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猪GPIHBP1和ApoCⅡ基因分子作用机理的初步研究
作 者: 邢淑华
导 师: 姜延志
学 校: 四川农业大学
专 业: 动物学
关键词: 猪 GPIHBP1 ApoCⅡ 组织表达谱 遗传多样性
分类号: S828
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)是脂质代谢的关键酶,其正常调控对于机体向组织提供脂质营养至关重要。作为LPL重要的调控因子,糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1(Glycosylphosphatidylinositol-anchored high density lipoprotein—binding protein1,GPIHBP1)能与LPL结合起脂解平台的作用,并作为载体参与LPL向毛细血管内皮细胞的转运。载脂蛋白CII(Apolipoprotein CII,ApoCII)是LPL的激活剂,可提高LPL活性促进脂解代谢。尽管最近几年通过对小鼠和人GPIHBP1和ApOCⅡ分子的研究,已初步揭示GPIHBPl和ApoCⅡ在脂肪代谢中的生理功能,但对其在机体内的分子作用机制还有待深入研究。而且,GPIHBP1和ApoCⅡ分子在猪脂肪代谢中的分子作用机制迄今国内外尚无报道。文章利用分子生物学实验技术,从分子、个体和群体三个层面对猪GPIHBP1和ApoCⅡ基因DNA序列、组织表达谱及遗传多样性三个方面进行了研究,取得如下结果:(1)获得猪GPIHBP1基因1984bp和ApoCⅡ基因2061bp DNA全序列。猪GPIHBP1基因由4个外显子和3个内含子组成,编码184氨基酸残基,在氨基酸水平上与人、小鼠和牛的同源性分别为53%、51%和65%。猪ApoCⅡ基因由4个外显子和3个内含子组成,编码101氨基酸残基,在氨基酸水平上与人、小鼠和牛的同源性分别为62%、59%和75%。(2)利用荧光定量PCR技术,对180日龄猪只的17个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、眼肌、腰肌、背部皮下外层脂肪、背部皮下内层脂肪、大网膜、小网膜、腹部皮下脂肪、板油组织、卵巢和睾丸)中的GPIHBP1和ApoCⅡ基因mRNA表达水平进行检测,并分析性别对其表达量的影响。结果发现:猪GPIHBP1与LPL基因在mRNA水平上其组织表达模式相似,两者在脂肪组织和肌肉组织中高水平表达,在其他组织中也出现出不同程度的表达。尽管GPIHBP1基因mRNA在肺中也高水平表达,但LPL基因mRNA在肺中则低水平表达。性别影响GPIHBP1基因在组织中的mRNA表达水平,母猪脂肪组织GPIHBP1基因mRNA表达量极显著高于其公猪表达量(P<0.01)。ApoCⅡ基因mRNA主要在肝脏组织中高水平表达,在其他组织也呈现出不同程度的表达,而LPL基因mRNA主要在脂肪组织和肌肉组织中高水平表达。性别影响ApoCⅡ基因在组织中mRNA表达水平,母猪脂肪组织和肝组织中的mRNA表达量极显著高于其公猪的表达量(P<0.01)。(3)采用直接测序法,对5个品种(金华猪、雅南猪、约克夏、长白猪和杜洛克)共266头个体的GPIHBP1和ApoCⅡ基因DNA全长进行直接测序。共筛选出猪GPIHBP1基因37个变异位点,在内含子区域出现31个变异位点,其中在第3内含子1014位点出现1个单碱基的插入/缺失;在外显子中出现5个变异位点,其中在695位点出现一个精氨酸→色氨酸的氨基酸变异;在3’非翻译区出现1个变异位点。猪ApoCⅡ基因共出现13个变异位点,在内含子有11个变异位点,其中在第1内含子846位点出现1个单碱基的插入/缺失;在外显子3中出现2个变异位点。(4)为进一步分析这些多态位点是否影响猪机体的脂肪代谢,我们在112头雅南猪群体中,对GPIHBPl和ApoCⅡ基因出现的多态位点与肌内脂肪含量和背膘厚进行了关联分析。结果发现,3PIHBP1基因中的255G>C变异位点和626T>G变异位点与肌内脂肪存在显著相关(P<0.05);1557T>C变异位点和1948G>A变异位点与背膘厚存在极显著相关(P<0.01);这4个多态位点的基因型分布在5个品种间存在极显著差异(P<0.01)。ApoCⅡ基因的551T>C变异位点和610A>G变异位点与背膘厚存在显著相关(P<0.05);这2个多态位点的基因型分布在5个品种间存在极显著差异(P<0.001)。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-10 1 文献综述 10-21 1.1 GPIHBP1基因研究进展 10-17 1.1.1 GPIHBP1基因发现与结构 10-12 1.1.2 GPIHBP1基因功能 12-14 1.1.3 GPIHBP1基因表达调节 14-16 1.1.4 GPIHBP1基因突变与人乳糜微粒血症 16-17 1.2 ApocⅡ基因研究进展 17-20 1.2.1 ApoCⅡ分子结构 17-18 1.2.2 ApoCⅡ基因功能 18-19 1.2.3 ApoCⅡ表达调节 19 1.2.4 ApoCⅡ基因突变 19-20 1.3 本研究的目的和意义 20-21 2 材料与方法 21-31 2.1 实验材料 21 2.1.1 实验猪群及表型数据 21 2.1.2 样品采集 21 2.2 主要仪器设备 21-22 2.3 实验试剂 22-23 2.4 常用试剂的配制 23 2.5 实验方法 23-31 2.5.1 基因组DNA和总RNA的提取 23-25 2.5.2 引物设计 25-26 2.5.3 PCR反应 26-27 2.5.4 cDNA的合成 27 2.5.5 标准品的制备 27-28 2.5.6 标准曲线制作 28 2.5.7 实时荧光定量PCR 28-29 2.5.8 肌内脂肪含量的测定 29-30 2.5.9 数据统计与分析 30-31 3 结果与分析 31-52 3.1 GPIHBHP1和ApoCⅡ基因克隆 31-36 3.1.1 猪基因组DNA检测 31-32 3.1.2 PCR产物检测 32-33 3.1.3 基因序列与结构分析 33-36 3.2 荧光定量PCR结果 36-46 3.2.1 Total RNA提取结果 36-37 3.2.2 标准曲线结果 37-39 3.2.3 扩增产物的特异性 39-40 3.2.4 GPIHBP1和ApoCⅡ基因差异表达分析 40-46 3.3 GPIHBP1和ApoCⅡ基因遗传多样性 46-52 3.3.1 GPIHBP1基因遗传多样性 46-48 3.3.2 ApoCⅡ基因遗传多样性 48-52 4 讨论 52-58 4.1 基因序列分析 52-53 4.2 基因的表达谱分析 53-55 4.2.1 内参基因的选择 53 4.2.2 基因表达差异的分析 53-55 4.3 多态位点分析 55-58 5 结论 58-59 参考文献 59-64 致谢 64
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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