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利用位点特异性整合酶生产无抗生素筛选标记的转基因奶牛

作　者: 余源
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: phiC31整合酶 Cre/loxP系统无抗生素筛选标记人β-防御素3 转基因牛
分类号: S823
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

转基因家畜是生物医学和农业研究领域的重要材料。而转基因动物生产过程中一般都需要用到抗生素筛选标记基因。获得转基因动物后，其体内残留的抗生素筛选标记存在生物安全方面的隐患，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁。本研究旨在建立一种安全高效的方法，为体细胞核移植（SCNT）提供无抗生素筛选标记的具有良好发育潜能的转基因供体细胞，为培育无抗生素筛选标记的转基因动物奠定基础。研究内容如下：1.基于假attP位点整合的通用型表达载体构建及功能验证利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）合成attB序列及其他载体元件，构建基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG，评估载体pARNG的主要功能元件。结果显示：通过SOE-PCR合成的attB片段能够在phiC31整合酶的介导下发生位点特异性重组，载体中的双荧光报告系统可以正确指示转染阳性细胞和Cre介导的重组反应。2.利用phiC31整合酶mRNA生产转基因胎牛成纤维细胞通过体外转录制备phiC31整合酶（Int）mRNA和突变失活型整合酶（mtInt）mRNA。构建验证phiC31整合酶功能的载体pPBstop-eGFP并与phiC31mRNA共电转胎牛成纤维细胞，通过流式细胞术（FACS）分析和γ-H2AX免疫荧光染色确定转染试验中phiC31IntmRNA最优使用剂量为1μg。构建含有attB位点的HBD3乳腺特异性表达载体pARNG-HBD3，在phiC31mRNA的介导下转染胎牛成纤维细胞，在稳定转染的细胞克隆中检测到7个假attP位点，其中BFF2为整合热点，28%稳定转染克隆中存在该位点的整合。利用生物信息学软件分析这些位点序列特征，并按照“基因组安全港”标准重新评估牛基因组中已公布的所有假attP位点。经过进一步鉴定获得HBD3基因单拷贝整合在BFF2“基因组安全港”的细胞克隆。3.利用Cre穿膜肽切除转基因细胞中的抗性筛选标记原核表达、纯化His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白，同时构建验证Cre重组酶功能的胎牛成纤维细胞株BFF2-L2stop优化Cre穿膜肽转导条件。结果显示使用终浓度为100μg/mLHis-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白转导胎牛成纤维细胞时，重组效率可达70%，并且对细胞无明显毒性。通过细胞免疫荧光染色证实His-NLS-TAT-Cre重组蛋白在细胞中主要定位于细胞核。利用His-NLS-TAT-Cre重组蛋白转导单拷贝整合pARNG-HBD3的转基因胎牛成纤维细胞并进行FACS分选，Southern blot证实分选得到的只表达绿色荧光的细胞即是切除了抗生素筛选标记的转基因细胞。此外，本研究还证实了phiC31Int mRNA介导的BFF2位点的整合及后续His-NLS-TAT-Cre重组蛋白介导的抗生素筛选标记的切除不会对整合位点旁侧基因的表达造成影响，且获得的转基因细胞染色体数目正常（2n=58+XX）。4.通过SCNT生产无抗生素筛选标记的转HBD3基因克隆牛以去除抗性筛选标记的转HBD3基因胎牛成纤维细胞作为供体细胞进行体细胞核移植，获得转基因囊胚后经过胚胎移植，最终获得12头健康的无抗生素筛选标记的转基因奶牛，对其中5头泌乳期的转基因奶牛进行分析，在乳汁中均能检测到HBD3表达，含量为3.9~10.4μg/mL。利用体外琼脂糖扩散试验和乳腺内攻菌试验检验转基因牛抗S.aureus和E.coli感染能力。在分别灌注S. aureus和E.coli细菌培养物的15个转基因奶牛乳房中，检测到33.3%和6.7%的乳腺发生感染，而灌注非转基因奶牛的15个乳房分别检测到93.3%和86.7%的乳腺发生感染。结果表明，转HBD3基因克隆牛可以显著抵抗S. aureus和E. coli的感染。值得注意的是，HBD3基因整合在BFF2位点的转基因奶牛乳汁中HBD3含量较高,在攻菌试验中从未感染。研究表明通过联合使用phiC31整合酶mRNA、His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白、双荧光报告系统和FACS分选技术可以安全高效地生产无抗生素筛选标记的转基因供体细胞，为SCNT准备具有良好发育潜能的转基因供体细胞，并培育出对乳腺炎致病菌具有抵抗能力的转基因克隆牛。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
文献综述  14-34
  第一章转基因动物的应用  14-21
    1.1 利用转基因动物乳腺生产药用蛋白  14-15
    1.2 转基因家畜在农业方面的应用  15-18
      1.2.1 利用转基因家畜提高动物的生产性能  15
      1.2.2 动物转基因抗病育种  15-18
    1.3 转基因动物生产技术  18-21
      1.3.1 体细胞核移植技术  18
      1.3.2 慢病毒介导的转基因技术  18
      1.3.3 条件性转基因表达  18
      1.3.4 人工染色体载体  18-19
      1.3.5 精原细胞介导的转基因技术  19
      1.3.6 RNA 干扰  19
      1.3.7 锌指核酸酶技术  19-21
  第二章 PhiC31 整合酶介导的位点特异性整合  21-34
    2.1 位点特异性重组酶  21-23
    2.2 PhiC31 整合酶的整合机理及在其它生物中的优化  23-26
    2.3 PhiC31 整合酶在不同生物中的应用  26-29
      2.3.1 PhiC31 整合酶在植物中的应用  26
      2.3.2 PhiC31 整合酶在非脊椎动物中的应用  26-27
      2.3.3 PhiC31 整合酶在脊椎动物中的应用  27-29
    2.4 PhiC31 整合酶在治疗学方面的应用  29-31
      2.4.1 PhiC31 整合酶在 in vito 基因治疗中的研究  29-30
      2.4.2 PhiC31 整合酶在 ex vivo 基因治疗中的研究  30-31
    2.5 PhiC31 整合酶在多能干细胞中的应用  31-32
    2.6 PhiC31 整合酶系统的安全性  32-33
    2.7 PhiC31 整合酶联合其他重组酶的应用前景  33-34
试验研究  34-101
  第三章基于假 attP 位点整合的通用型表达载体构建及功能验证  34-48
    3.1 材料和试剂  34-35
      3.1.1 材料  34
      3.1.2 试剂  34-35
    3.2 方法  35-40
      3.2.1 通过重叠延伸 PCR 合成载体元件  35-36
      3.2.2 一种基于假 attP 位点整合的通用型表达载体的构建  36-37
      3.2.3 attB 序列功能评估  37-40
      3.2.4 双荧光报告系统功能验证  40
    3.3 结果  40-45
      3.3.1 attB 片段、LoxP2 片段和 MCS 片段的凝胶电泳检测  40-41
      3.3.2 通用型表达载体 pARNG 的鉴定  41-42
      3.3.3 attB 序列在 HEK293 细胞中的位点特异性整合  42-44
      3.3.4 双荧光报告系统在 HEK293 细胞上的功能验证  44-45
    3.4 讨论  45-47
    3.5 小结  47-48
  第四章利用 phiC31 整合酶 mRNA 生产转基因胎牛成纤维细胞  48-71
    4.1 材料和试剂  48-49
      4.1.1 材料  48-49
      4.1.2 试剂  49
    4.2 方法  49-55
      4.2.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的原代培养与性别鉴定  49-50
      4.2.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的制备  50
      4.2.3 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证及转染优化  50-52
      4.2.4 HBD3 乳腺特异性表达载体构建及转染胎牛成纤维细胞  52-53
      4.2.5 稳定转染细胞克隆的鉴定  53-55
      4.2.6 数据统计  55
    4.3 结果  55-68
      4.3.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定  55
      4.3.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的体外转录  55-56
      4.3.3 PhiC31 整合酶功能验证载体构建及功能验证  56-57
      4.3.4 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证  57-59
      4.3.5 PhiC31 整合酶 mRNA 转染对胎牛成纤维细胞的潜在毒性  59-60
      4.3.6 HBD3 乳腺特异性表达载体的构建及稳定转染单克隆细胞的获得  60-62
      4.3.7 稳定转染的胎牛成纤维细胞克隆的鉴定  62-68
    4.4 讨论  68-70
    4.5 小结  70-71
  第五章利用 Cre 穿膜肽切除转基因细胞中的抗性筛选标记  71-89
    5.1 材料与试剂  71-72
      5.1.1 材料  71-72
      5.1.2 试剂  72
    5.2 方法  72-77
      5.2.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化  72-73
      5.2.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白转导胎牛成纤维细胞的优化  73-74
      5.2.3 用流式细胞术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞  74
      5.2.4 无抗生素筛选标记的转基因细胞的鉴定  74-77
      5.2.5 数据统计  77
    5.3 结果  77-86
      5.3.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化  77-78
      5.3.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白对胎牛成纤维细胞转导条件的优化  78-82
      5.3.3 基于 FACS 技术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞  82-84
      5.3.4 FACS 分选的转基因细胞的鉴定  84-86
    5.4 讨论  86-87
    5.5 小结  87-89
  第六章通过 SCNT 生产无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因克隆牛  89-101
    6.1 材料与试剂  89-90
      6.1.1 试验动物  89
      6.1.2 试剂  89-90
    6.2 方法  90-92
      6.2.1 卵母细胞的采集、成熟培养和去核  90
      6.2.2 无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因的胎牛成纤维细胞的准备  90
      6.2.3 核移植及转基因克隆胚获得  90
      6.2.4 转基因克隆胚 PCR 检测  90
      6.2.5 转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定  90-91
      6.2.6 转基因牛的 Southern blot 鉴定  91
      6.2.7 转基因牛乳汁采集和成分分析  91
      6.2.8 HBD3 在转基因牛乳汁中的表达分析  91
      6.2.9 转基因牛乳汁中重组 HBD3 的体外抗菌活性检测  91-92
      6.2.10 乳腺表达 HBD3 转基因牛的攻菌实验  92
      6.2.11 数据统计  92
    6.3 结果  92-99
      6.3.1 转基因克隆胚的获得与鉴定  92-93
      6.3.2 SCNT 效率及转基因胚胎发育情况  93-95
      6.3.3 转基因克隆牛的获得与 Southern blot 鉴定  95
      6.3.4 转基因牛乳汁成分分析  95-96
      6.3.5 转基因牛乳汁中 HBD3 的表达  96-97
      6.3.6 转基因牛乳体外抑菌活性  97-98
      6.3.7 转基因牛攻菌实验结果  98-99
    6.4 讨论  99-100
    6.5 小结  100-101
全文结论  101-102
创新之处和进一步研究的课题  102-103
参考文献  103-118
附录  118-120
致谢  120-121
个人简介  121

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