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胡杨XTH调控烟草盐诱导肉质化及缓解重金属胁迫的机理研究

作 者: 韩彦莎
导 师: 陈少良
学 校: 北京林业大学
专 业: 植物学
关键词: 胡杨 烟草 木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶 肉质化 抗盐性 Cd2+ 木葡聚糖
分类号: S792.11
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


盐离子和重金属离子抑制植物正常的生长发育。过高的盐浓度会破坏植物体内的水分平衡、离子平衡和活性氧平衡;而过量的重金属离子(如Cd2+)能够通过干扰光合、呼吸、营养平衡等生理过程来抑制植物生长,甚至导致植物死亡。在我国西北干旱盐碱的荒漠地区,胡杨(Populus euphrattca)是唯一能够成林的乔木树种。胡杨叶片在长期盐处理后能够发生肉质化,起到稀释组织和细胞中盐分的作用,但盐诱导肉质化的分子机制尚不清楚。另有研究表明,胡杨对Cd2+的响应非常敏感,但其对重金属胁迫的响应和适应机理还不明确。木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶 的学位论文">木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶调控细胞壁的松弛和伸展。本实验室前期从胡杨叶片中克隆得到PeXTH全长基因,荧光定量PCR结果显示该基因在长期盐胁迫下的表达呈上调趋势,因此PeXTH很有可能参与盐诱导的胡杨叶片肉质化的发生,从而提高胡杨的抗盐性。此外,XTH基因能够响应重金属胁迫,在低浓度的Cd2+胁迫下,胡杨PeXTH基因的表达水平提高了1.2~2.1倍,因而该基因也可能参与胡杨适应Cd2+胁迫的生理过程。本论文利用转基因技术,将PeXTH基因在模式植物烟草中过量表达,通过比较转基因烟草和野生型烟草在叶片显微结构、形态表型、生理特征等方面的差异表现,探讨了PeXTH在植物适应盐胁迫和重金属胁迫中的作用机制。主要研究结果如下:1.PeXTH蛋白具有木葡聚糖内转糖苷酶(XET)的催化活性域DEIDFEFLG,且定位在内质网和细胞壁上。2.PeXTH的纯化蛋白大小约为35kD,且具有体外XET活性。该蛋白发挥活性的最适温度是37℃,最适pH是6.0。3.PeXTH通过调控组织肉质化来提高植物耐盐性。实验表明,PeXTH基因的过表达使转基因烟草的抗盐性增加,盐胁迫下转基因烟草的存活率和根长都明显高于野生型。这种变化来源于转基因烟草叶片显微结构和生理特征的改变:同野生型烟草相比,转基因烟草的肉质化程度明显提高,栅栏组织细胞排列更为紧密,叶肉细胞的胞间隙较小,从而导致转基因烟草单位叶面积水含量和鲜/干重比值这两个肉质化指标分别比野生型烟草高36%和39%;这种显微结构的变化一方面可以达到稀释盐分的效果,另一方面也有助于提高转基因烟草的叶片保水力,从而在盐胁迫下起到稀释叶组织和细胞盐浓度的作用。此外,叶肉细胞数目的增加和胞间隙的减小还有利于碳利用率和光合效率的提高。总之,PeXTH基因的过表达能够通过引发叶片肉质化来提高转基因烟草的抗盐性。4.PeXTH还可以缓解植物的Cd2+胁迫。PeXTH基因的过表达能够使转基因烟草的抗Cd2+性提高,Cd2+胁迫下转基因烟草叶和根生长受到的抑制明显较小:Cd2+胁迫下,转基因烟草根系的Cd2+内流显著低于野生型烟草,从而使转基因烟草根尖和根成熟区中积累的Cd2+比野生型烟草少49%-58%;值得注意的是,转基因烟草根系的木葡聚糖降解活性比野生型烟草高56%~87%,导致根细胞壁中的木葡聚糖含量比野生型烟草低25%~27%。由此可见,PeXTH基因的过表达提高了转基因烟草根系的木葡聚糖降解活性,降低了根细胞壁中的木葡聚糖含量,导致Cd2+结合位点减少,从而使根系对Cd2+的吸收减弱,减少了Cd2+在根中的积累,最终缓解了Cd2+对转基因烟草的毒害。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-13
縮略词表  13-14
引言  14-17
1 文献综述  17-33
  1.1 胡杨抗盐机制的研究进展  17-22
    1.1.1 离子平衡调控  17-21
      1.1.1.1 盐离子根冠运输的限制  17-18
      1.1.1.2 K~+/Na~+平衡的调控  18-20
      1.1.1.3 Cl~-平衡的调控  20-21
    1.1.2 活性氧平衡的调控  21
    1.1.3 胡杨组织肉质化  21-22
  1.2 XTH的研究进展  22-29
    1.2.1 XTH与细胞壁重构  22-24
    1.2.2 XTHs的酶活性质、蛋白结构和家族分类  24-25
    1.2.3 XTH基因的表达模式  25-28
      1.2.3.1 XTH基因的时空表达  26-27
      1.2.3.2 XTH基因的表达受激素和环境的调控  27-28
    1.2.4 XTH基因的生理功能  28-29
      1.2.4.1 XTH与植物的生长发育  28
      1.2.4.2 XTH与非生物胁迫  28-29
  1.3 植物对重金属Cd~(2+)的解毒机制研究进展  29-31
    1.3.1 多肽螯合  29
    1.3.2 液泡区隔  29-30
    1.3.3 激活抗氧化系统  30
    1.3.4 细胞壁固定  30-31
  1.4 本论文问题的提出及研究目的  31-33
2 胡杨PeXTH的序列分析和亚细胞定位  33-46
  2.1 实验材料、试剂和方法  33-39
    2.1.1 载体与菌株  33
    2.1.2 试剂  33
    2.1.3 溶液配制  33-34
    2.1.4 方法  34-39
      2.1.4.1 系统进化树构建  34
      2.1.4.2 氨基酸序列比对  34
      2.1.4.3 定位载体pMDC85::PeXTH的构建  34-38
      2.1.4.4 基因枪转化洋葱表皮细胞  38-39
      2.1.4.5 激光共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞  39
  2.2 结果  39-43
    2.2.1 氨基酸序列比对  39-40
    2.2.2 进化树分析  40-42
    2.2.3 亚细胞定位  42-43
      2.2.3.1 重组载体pMDC85::PeXTH的构建和鉴定  42
      2.2.3.2 基因枪转化  42-43
  2.3 讨论  43-45
  2.4 小结  45-46
3 PeXTH蛋白的原核表达及酶活测定  46-56
  3.1 实验材料、试剂和方法  46-52
    3.1.1 质粒与菌株  46
    3.1.2 试剂配制  46-48
    3.1.3 方法  48-52
      3.1.3.1 表达载体pET28a::PeXTH的构建  48-50
      3.1.3.2 PeXTH蛋白的原核表达和纯化  50-51
      3.1.3.3 PeXTH纯化蛋白的酶学活性测定  51-52
  3.2 结果  52-54
    3.2.1 PeXTH蛋白的诱导表达  52
    3.2.2 重组蛋白的纯化  52
    3.2.3 PeXTH纯化蛋白的酶学活性  52-54
  3.3 讨论  54-55
    3.3.1 PeXTH蛋白的诱导和纯化条件  54-55
    3.3.2 PeXTH蛋白的酶活性质  55
  3.4 小结  55-56
4 胡杨PeXTH基因的表达分析和遗传转化  56-68
  4.1 实验材料、试剂和方法  56-63
    4.1.1 植物材料  56
    4.1.2 质粒与菌株  56
    4.1.3 试剂  56
    4.1.4 培养基和溶液配制  56-57
    4.1.5 方法  57-63
      4.1.5.1 盐处理和镉处理  57-58
      4.1.5.2 胡杨根、叶组织的RNA提取  58-59
      4.1.5.3 荧光定量PCR  59-60
      4.1.5.4 农杆菌介导PeXTH基因转化烟草  60-61
      4.1.5.5 烟草叶片DNA提取和基因组PCR验证  61-62
      4.1.5.6 烟草叶片RNA提取和RT-PCR验证  62-63
      4.1.5.7 T2代纯合子的获得  63
  4.2 结果  63-66
    4.2.1 PeXTH的表达特征分析  63
    4.2.2 转基因烟草的筛选和鉴定  63-66
      4.2.2.1 转空载体株系的筛选和鉴定  64-65
      4.2.2.2 转PeXTH基因株系的筛选和鉴定  65-66
  4.3 讨论  66-67
  4.4 小结  67-68
5 转PeXTH基因烟草的肉质化和抗盐性分析  68-83
  5.1 实验材料和方法  68-71
    5.1.1 植物材料和培养条件  68
    5.1.2 方法  68-71
      5.1.2.1 RT-PCR和荧光定量PCR检测  68
      5.1.2.2 转基因烟草的抗盐表型筛选  68-69
      5.1.2.3 叶片显微结构的观察  69-70
      5.1.2.4 叶片肉质化程度(LSD)的测定  70
      5.1.2.5 叶片保水力(WRC)的测定  70
      5.1.2.6 叶片Na~+、Cl~-离子浓度的测定  70-71
      5.1.2.7 叶细胞Na~+离子含量的荧光检测  71
      5.1.2.8 叶片光合效率的测定  71
  5.2 结果  71-81
    5.2.1 转基因烟草的抗盐性筛选  71-74
    5.2.2 转基因烟草叶片显微结构的变化  74-75
    5.2.3 转基因烟草叶片的肉质化程度和保水力  75-76
    5.2.4 转基因烟草叶组织中的Na~+、Ck~-离子浓度  76
    5.2.5 转基因烟草叶肉细胞中的Na~+离子含量  76
    5.2.6 转基因烟草的光合能力  76-81
  5.3 讨论  81-82
    5.3.1 转PeXTH基因烟草的植株抗盐性和叶片肉质化  81
    5.3.2 PeXTH基因诱导的叶片肉质化和抗盐性的关系  81-82
  5.4 小结  82-83
6 转PeXTH基因烟草的抗镉性分析  83-95
  6.1 实验材料和方法  83-87
    6.1.1 植物材料和培养条件  83
    6.1.2 溶液配制  83-84
    6.1.3 方法  84-87
      6.1.3.1 RT-PCR检测  84
      6.1.3.2 转基因烟草的抗Cd~(2+)表型  84
      6.1.3.3 Cd~(2+)离子的荧光检测  84
      6.1.3.4 Cd~(2+)离子流的测定  84-85
      6.1.3.5 木葡聚糖降解活性(XDA)的测定  85-86
      6.1.3.6 木葡聚糖含量的测定  86-87
  6.2 结果  87-91
    6.2.1 转基因烟草的抗Cd~(2+)性  87-89
    6.2.2 根细胞中的Cd~(2+)分布  89-91
    6.2.3 根Cd~(2+)离子流  91
    6.2.4 根组织中的木葡聚糖含量和木葡聚糖降解活性(XDA)  91
  6.3 讨论  91-93
    6.3.1 Cd~(2+)离子的吸收、积累与抗Cd~(2+)性  91-93
    6.3.2 细胞壁木葡聚糖含量在抗Cd~(2+)性中的重要性  93
  6.4 小结  93-95
7 结论与展望  95-97
  7.1 结论  95
  7.2 创新点  95-96
  7.3 展望  96-97
参考文献  97-110
个人简介  110-111
博士在读期间成果清单  111-112
导师简介  112-113
致谢  113

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