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牡丹Ty1-copia类反转录转座子LTR序列的分离及其种质资源评价

作　者: 张曦
导　师: 侯小改
学　校: 河南科技大学
专　业: 植物学
关键词: 牡丹 Ty1-copia类反转录转座子 iPBS SSAP分子标记种质资源遗传多样性
分类号: S685.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）属于芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia L.）牡丹组（Sect. Mouton DC.）的木本植物，起源古老，是科学界公认的比较原始被子植物之一，具有较高的经济价值。在中国数千年栽培及自然选择和人工引种下，牡丹已积累了丰富的遗传多样性资源，然而目前在牡丹上的研究多基于生理生化的水平上，利用反转录转座子等分子水平上对牡丹种质资源进行评价的研究至今尚未报道。本试验利用自己开发的方法从牡丹基因组中分离出Ty1-copia类反转录转座子LTR序列并对其进行系统地分析，最后根据分离出的LTR序列设计引物对牡丹进行SSAP分子标记试验，进而进行种质资源评价，主要研究结果如下：1.试验采用自主开发的巢式PCR方法分离牡丹Ty1-copia类反转录转座子LTR序列并已申请专利。本试验使用一种结合了hiTAIL-PCR，抑制PCR及退火控制引物三种技术优点的方法，经过2条嵌套引物（RNase H1引物和RNase H2引物）结合改造后的ACP引物以及通用引物UP的三轮巢式PCR后，扩增产物连接于载体并转化、筛选、阳性克隆鉴定后，送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定，从‘洛阳红’牡丹品种基因组DNA中成功分离出22条Ty1-copia类反转录转座子LTR序列。这些序列中有20条含有PPT及通用引物，经过DNAstar等软件将序列比对后，发现这些序列在5端都有反转录转座子保守序列PPT，紧随其后的03bp有LTR序列的起始标志TG（A），而在序列的3末端有UP通用引物序列。基于反转录转座子在RNase H保守区和软件比对的结果，可以将这20条序列确定为牡丹Ty1-copia类反转录转座子LTR序列，登陆号分别为KC519444到KC519464。2.试验利用iPBS方法从西北牡丹品种‘红绣球’和中原品种‘洛阳红’中扩增出目的条带，经回收，克隆，测序，获得了12条来自牡丹LTR类反转录转座子的LTR序列，并使用DNAMAN、DNAstar和Vector NTI等相关序列分析软件进行序列分析后，发现这些序列两端都有iPBS引物的存在，保守区域PBS后也可找到LTR序列的起始标志TG（CA）。另外这些核苷酸序列表现出较高的异质性，主要表现为缺失突变，序列长度变化范围为313～894bp，同源范围从31.1%到65.8%不等。将其氨基酸序列与已登录的不同植物LTR类反转录转座子LTR氨基酸序列进行聚类分析，结果表明与其它某些植物具有一定的相关性，表明它们间可能存在着LTR类反转录转座子的横向传递作用。3.试验基于前两个试验分离出反转录转座子LTR序列的基础上，在牡丹上开发出SSAP（特异序列扩增多态性；sequence-specific amplification polymorphism）分子标记，并在牡丹种质鉴定和亲缘关系分析进行研究，并对每组SSAP引物单独用于牡丹遗传分析的性能作了探讨。8个反转录转座子引物均根据试验1中分离的牡丹Ty1-copia类反转录转座子LTR序列设计合成，经过与7个末端带有3个选择性碱基的Mse I或EcoR I接头引物组合筛选后，使用可产生清晰丰富条带的12对组合进行SSAP标记，在牡丹野生种、国外牡丹品种以及国内不同地域牡丹品种共计151个牡丹种或品种中共扩增出415个位点（多态位点92.77%）每对引物平均产生35个位点（33个多态位点），表明SSAP分子标记是一种高多态性的标记方法且在牡丹种质资源分析具有较高的应用价值；本试验还进行UPGMA聚类后的品种、产地、花色分析，结果表明多数来源地相同的牡丹品种表现出密切的亲缘关系，然而也存在同一来源地的品种没有聚类一组的情况，花型花色等表面性状与聚类结果有一定联系，但多数聚类结果与性状并未有一致的相关性，而聚类结果与地域分布和进化远近有较高的符合度。另外利用MCID（manual cultivar identificationdiagram）法将DNA标记结果对151个牡丹样本进行指纹图谱的构建，仅用4对引物就能够将151个牡丹样本在分子水平上区分开，所得的品种鉴定图谱比聚类树更具直观性与实用性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法对牡丹种质资源的鉴定以及牡丹品种分类和种质鉴定具有积极的意义。试验利用SSAP分子标记技术对牡丹种质资源研究的开展，不仅开发了牡丹分子标记的新方法，也为牡丹种质资源研究和后续试验的开展奠定了实验基础和理论依据。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-10
第1章引言  10-18
  1.1 牡丹  10-11
    1.1.1 牡丹概况  10
    1.1.2 牡丹栽培简史  10-11
    1.1.3 牡丹品种资源  11
  1.2 植物反转录转座子  11-13
    1.2.1 植物反转录转座子概述  11
    1.2.2 反转录转座子的类型和结构  11-12
    1.2.3 植物反转录转座子的特性  12-13
  1.3 植物分子标记研究进展  13-14
    1.3.1 DNA 分子标记技术  13
    1.3.2 基于植物反转录转座子的分子标记技术  13-14
  1.4 反转录转座子 LTR 序列的分离  14-18
    1.4.1 磁珠富集法  15
    1.4.2 抑制 PCR 法  15-16
    1.4.3 SiteFinding PCR 法  16
    1.4.4 iPBS 方法  16-18
第2章巢式 PCR 方法分离牡丹 LTR 序列  18-28
  2.1 引言  18
  2.2 原理  18-21
    2.2.1 引物设计基础  18-19
    2.2.2 引物设计原理  19-20
    2.2.3 试验流程  20-21
  2.3 材料和方法  21
    2.3.1 材料  21
    2.3.2 方法  21
    2.3.3 序列分析  21
  2.4 结果与分析  21-26
  2.5 讨论  26-28
第3章利用 iPBS 方法分离牡丹反转录转座子 LTR 序列  28-36
  3.1 引言  28
  3.2 材料  28-29
  3.3 方法  29
    3.3.1 PCR 体系及程序  29
    3.3.2 PCR 产物纯化、克隆及转化  29
  3.4 结果与分析  29-34
    3.4.1 反转录转座子 LTR 序列的 PCR 扩增及克隆测序  29-32
    3.4.2 LTR 核苷酸序列的分析  32-33
    3.4.3 牡丹与其它物种 LTR 类反转录转座子聚类分析  33-34
  3.5 讨论  34-36
第4章牡丹种质资源 SSAP 分子标记分析  36-58
  4.1 引言  36
  4.2 材料与方法  36-42
    4.2.1 材料  36-39
    4.2.2 方法  39-40
    4.2.3 SSAP 分子标记  40-41
    4.2.4 SSAP 分子标记引物的筛选  41
    4.2.5 SSAP 分子标记的数据统计  41
    4.2.6 DNA 指纹图谱构建  41-42
  4.3 结果与分析  42-56
    4.3.1 引物筛选  42-43
    4.3.2 SSAP 多态性分析  43-45
    4.3.3 SSAP 相似指数  45
    4.3.4 SSAP 聚类分析  45-51
    4.3.6 DNA 指纹图谱构建  51-56
  4.4 讨论  56-58
第5章结论  58-60
  5.1 牡丹 LTR 序列的分离  58
  5.2 牡丹 SSAP 分子标记  58-60
参考文献  60-68
附录 A  68-76
附录 B  76-82
附录 C  82-86
致谢  86-88
攻读硕士学位期间的研究成果  88

牡丹Ty1-copia类反转录转座子LTR序列的分离及其种质资源评价

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