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萼脊兰AP1(APETALA1)基因的序列分析及表达特性研究

作 者: 张国付
导 师: 崔波
学 校: 河南农业大学
专 业: 植物学
关键词: 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因 克隆 实时荧光定量 表达分析 载体构建
分类号: S682.31
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


萼脊兰(Sedirea japonica)为兰科(Orchidaceae)萼脊兰属(Sedirea)植物,其花小而素雅,花色清丽,且具有奇妙的幽香,观赏期长,养护简单且耐寒,是一种观赏价值很高的附生兰。近年来随着分子生物学在花卉相关研究及其在育种过程中的应用,兰科植物相关基因特别是开花相关基因及其表达也成为当今研究的热点,但是对萼脊兰开花相关基因的研究还很少。本研究以萼脊兰的花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术等方法,克隆出了萼脊兰与开花相关的AP1(APETALA1)基因的保守序列及其全长序列开放阅读框(ORF)的扩增,并对该序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在生长发育过程中不同时期不同部位的表达特性,并对萼脊兰AP1(APETALA1)基因进行了植物表达载体的构建。主要研究结果如下:1萼脊兰AP1(APETALA1)基因cDNA全长序列的克隆及序列分析以萼脊兰的花期花瓣为材料,通过植物总RNA提取试剂盒提取萼脊兰花期花瓣总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了萼脊兰AP1(APETALA1)基因的保守序列片段,其中与蝴蝶兰、建兰、文心兰的同源性分别为:99%,90%、88%。采用RACE技术的方法扩增3’端和5’端,得到一条萼脊兰AP1(APETALA1)基因的全长序列,长度为1221bp,其中开放阅读框(ORF)为753bp,编码250个氨基酸,5′端非编码区为66bp,3′端非编码区为402bp。采用生物学信息分析方法对萼脊兰AP1基因氨基酸理化性质及同源性进行分析,并构建系统发育树,对保守区及二级结构进行分析及预测。2萼脊兰AP1(APETALA1)基因植物表达载体pCAMBIA1304-EJAP1的构建将测序结果正确的pMD19-EJAP1和质粒pBI221经限制性内切酶SmaⅠ/XbaⅠ双酶切后,经T4DNA连接酶连接到中间载体pBI221上,构建中间载体质粒pBI221-EJAP1。再将酶切结果正确的中间载体pBI221-EJAP1和植物表达载体pCAMBIA1304经限制性内切酶PstI/EcoRI双酶切后,将回收的目的基因片段与植物表达载体pCAMBIA1304用T4DNA连接酶连接,构建植物重组表达质粒pCAMBIA1304-EJAP1。经过菌落筛选和PCR双酶切验证,最终得到萼脊兰AP1(APETALA1)基因的植物表达载体pCAMBIA1304-EJAP1,为遗传转化及杂交验证打下基础。3采用实时荧光定量PCR技术对萼脊兰AP1基因进行时空表达分析分别提取萼脊兰不同发育阶段不同部位组织的RNA,反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR,按照Rel. Exp=2-ΔΔCt公式进行目的基因相对表达量的计算,结果发现,萼脊兰AP1基因在苗期、花蕾期、盛花期的营养器官和生殖器官中都有表达,且具有不同的表达丰度特性。在苗期,根和叶中表达量较低;在花蕾期,根和叶中的表达量与苗期相似,具有较低的表达量;而花葶和花蕾中表达量较高,花葶中表达量最高;在盛花期,根中的表达量比叶高,仍以花葶的表达量为最高,在花器官中,AP1基因在花瓣、萼片、唇瓣有微量表达,在蕊柱有较高表达,在子房中的表达量最高。结果分析表明,萼脊兰AP1(APETALA1)基因不仅在启动花分生组织和花器官分化中起着重要作用,而且在也参与其它组织的发育。

全文目录


致谢  4-7
摘要  7-8
1 文献综述  8-14
  1.1 兰科植物的研究进展  8-9
    1.1.1 兰花育种方法  8-9
    1.1.2 兰花转基因研究  9
  1.2 萼脊兰的研究进展  9-10
    1.2.1 萼脊兰的组织培养  9
    1.2.2 萼脊兰的转基因研究  9-10
  1.3 RACE 技术  10-13
    1.3.1 RACE 技术原理  10-12
    1.3.2 RACE 技术在植物基因研究上的应用现状  12-13
  1.4 AP1 基因及研究进展  13-14
    1.4.1 AP1 基因结构和功能  13
    1.4.2 AP1 基因的研究进展  13-14
2 引言  14-15
3 材料和方法  15-30
  3.1 萼脊兰花瓣总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成  15-17
    3.1.1 试验材料  15
    3.1.2 试验方法  15-17
  3.2 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因片段的克隆  17-20
    3.2.1 试验材料  17
    3.2.2 试验方法  17-20
  3.3 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因全长序列的获得及开放阅读框(ORF)扩增  20-25
    3.3.1 试验材料  20-21
    3.3.2 试验方法  21-25
  3.4 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因植物表达载体 pCAMBIA1304-EJYAP1 的构建  25-27
    3.4.1 试验材料  25
    3.4.2 试验方法  25-27
  3.5 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因的时空表达分析  27-30
    3.5.1 试验材料  27-28
    3.5.2 试验方法  28-30
4 结果与分析  30-43
  4.1 总 RNA 的提取与检测结果  30
    4.1.1 总 RNA 的电泳结果分析  30
    4.1.2 RNA 浓度检测  30
  4.2 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因片段的克隆及全长序列的获得  30-39
    4.2.1 萼脊兰 AP1 基因片段的克隆  30-31
    4.2.2 萼脊兰 AP1 基因 3’RACE 扩增  31-32
    4.2.3 萼脊兰 AP1 基因 5’RACE 扩增  32-33
    4.2.4 萼脊兰 AP1 基因 cDNA 全长的拼接及开放阅读框(ORF)的扩增  33-34
    4.2.5 萼脊兰 AP1 基因序列生物信息学分析  34-39
  4.3 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因中间载体 pBI221- EJAP1 的构建  39-40
  4.4 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因表达载体 pCAMBIA1304-EJAP1 的构建  40
  4.5 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因的时空表达分析  40-43
    4.5.1 RNA 提取及完整性检测  40-41
    4.5.2 实时荧光定量 PCR 结果分析  41-43
5 结论与讨论  43-46
  5.1 RNA 提取及 cDNA 合成  43-44
  5.2 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因片段克隆及全长获得  44
  5.3 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因植物表达载体的构建  44
  5.4 萼脊兰 AP1(APETALA1)基因的时空表达分析  44-45
  5.5 展望  45-46
参考文献  46-52
英文摘要  52-53

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺(花卉和观赏树木) > 多年生花卉类 > 其他花卉类 > 兰科植物
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