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香蕉5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因的克隆、生物信息学分析和表达分析

作 者: 龙芳
导 师: 李绍鹏;李茂富
学 校: 海南大学
专 业: 果树学
关键词: 香蕉 ALAD 基因克隆 遗传转化 低温胁迫 表达分析
分类号: S668.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要


香蕉为芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)植物,是典型的热带作物,对温度十分敏感,低温寒潮常造成香蕉品质和产量的下降,严重时甚至会导致植株死亡。5-氨基乙酰丙酸脱水酶(8-aminoaevulinic acid dehydratase, ALAD)是5-氨基乙酰丙酸脱水酶-胆色素原合成酶(ALAD-PBGS)超家族中的重要一员,催化两分子5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)合成叶绿素的生物前体——胆色素原(porphobilinogens, PBG),直接影响叶绿素的合成及植物光合作用,最终影响植物的抗寒性。ALAD基因具有较高的保守性,前人已对豌豆、西红柿等植物ALAD基因进行报道。香蕉ALAD基因未见报道,NCBI数据库上也找不到关于香蕉ALAD基因的记录。本研究以生产主栽品种巴西蕉幼苗为材料,克隆获得ALAD基因DBA序列及编码序列,并进行了生物信息学分析;通过RT-PCR技术检测ALAD基因在香蕉不同组织中的表达特性;通过RT-PCR技术、qRT-PCR技术和Western Blot杂交技术检测低温胁迫下香蕉叶片中ALAD基因及蛋白的表达特点;改造了植物逆境诱导启动子表达载体,在此基础上构建了带Bar抗性标记基因的表达载体pCAMBIA3301-rd29A-ALAD和pCAMBIA3301-35S-ALAD,并通过根癌农杆菌介导法转入拟南芥基因组中,对转基因拟南芥T3代幼苗进行低温胁迫处理,分析和鉴定ALAD基因的功能。主要结果如下:1、香蕉ALAD基因全长克隆。通过RACE技术克隆了香蕉ALAD基因的编码序列全长,并在此基础上通过常规PCR技术克隆获得基因DNA全长。2、香蕉ALAD基因的生物信息学分析。经过生物软件分析,所克隆的香蕉ALAD基因编码序列全长2109bp,开放阅读框(ORF)为1287bp,编码428个氨基酸;蛋白分子量为47kD左右,等电点(pI)值为6.97,接近于中性;含量最丰富的氨基酸为Ala、Leu、Val、Arg、Ser、Gly、Pro和Asp;含有ALAD活性结构域、ALAD-PGBS-aspartate-rich保守结构域、舍夫碱残基结构域和一个镁离子结合位点结构域;编码序列与其它植物的同源性为75%左右,氨基酸序列与其它植物的同源性为80%左右。ALAD基因DNA序列含有12个外显子,11个内含子3、ALAD基因在香蕉中的表达特性。利用RT-PCR技术分析香蕉ALAD基因在不同组织中的表达特性,发现其在叶片和幼茎中的表达量很高,在根中的表达量较小利用qRT-PCR技术分析低温胁迫下香蕉ALAD基因在叶片中的表达情况,结果显示,在低温胁迫开始的1h内基因表达量稍微上调,但随着低温胁迫时间的加长,ALAD基因的表达出现下调,胁迫8h后表达量又大幅上调;用Western Blot杂交技术检测了不同低温胁迫下香蕉叶片中ALAD蛋白的表达情况,结果表明,香蕉ALAD蛋白的含量随着低温胁迫时间的加长而减小,且在胁迫6h后含量显著低于对照。研究结果说明ALAD基因和蛋白的表达都响应了低温胁迫的过程。4、逆境诱导启动子表达载体的改造、转基因植株的获取以及ALAD基因功能分析。克隆了拟南芥逆境诱导型启动子rd29A,改造了逆境诱导型启动子植物表达载体pCAMBIA3301-rd29A,并构建了香蕉ALAD基因表达载体ALAD-rd29A-pCAMBIA3301和PCAMBIA3301-35S-ALAD,导入拟南芥中。经Bar基因除草剂抗性筛选以及PCR检测,将获得的T3代转基因拟南芥进行4℃低温胁迫处理3周并进行复苏培养4d,发现转香蕉ALAD基因的拟南芥较对照具有更强的抗寒性,且经过复苏培养后可恢复生长力,说明转基因拟南芥的耐寒性得到了提高。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
1 前言  10-23
  1.1 植物抗寒性研究进展  11-15
    1.1.1 低温胁迫对植物细胞膜系统的影响  11
    1.1.2 低温胁迫对植物体内渗透调节物质的影响  11-12
    1.1.3 低温胁迫对植物体内保护酶活性的影响  12
    1.1.4 低温对植物光合作用的影响  12-14
    1.1.5 植物抗寒性相关基因的研究  14-15
  1.2 香蕉抗寒性研究进展  15-16
    1.2.1 香蕉与低温胁迫的关系  15
    1.2.2 香蕉抗寒性相关基因的研究  15-16
    1.2.3 提高香蕉抗寒性的途径  16
  1.3 ALA的研究进展  16-17
  1.4 ALAD的研究进展  17-19
  1.5 逆境诱导型启动子的研究进展  19-21
  1.6 本研究的主要目的和意义  21-22
  1.7 研究技术路线  22-23
2 材料和方法  23-43
  2.1. 材料及主要仪器和试剂  23-24
    2.1.1 材料  23
    2.1.2 主要仪器及试剂  23-24
  2.2 方法  24-43
    2.2.1 香蕉ALAD基因的克隆  24-29
    2.2.2 目的基因片段的回收、连接转化以及测序  29-31
    2.2.3 ALAD基因的生物信息学分析  31-32
    2.2.4 香蕉ALAD基因表达特性的分析  32-34
    2.2.5 重组ALAD蛋白多克隆抗体的制备  34-37
    2.2.6 低温胁迫下香蕉叶片ALAD蛋白表达的Western Blot检测  37-38
    2.2.7 ALAD基因的遗传转化分析  38-43
3 结果与分析  43-65
  3.1 香蕉ALAD基因mRNA及DNA的克隆  43-47
    3.1.1 香蕉ALAD基因mRNA的克隆  43-45
    3.1.2 香蕉ALAD基因DNA的获得  45-47
  3.2 ALAD基因及编码序列相关的生物信息学分析  47-53
    3.2.1 ALAD基因同源性比对分析及ALAD蛋白家族系统进化树的构建  47-49
    3.2.2 氨基酸序列的组成成分及生理生化特性分析  49-51
    3.2.3 ALAD蛋白功能域的预测和分析  51-52
    3.2.4 ALAD蛋白高级结构分析和同源建模  52
    3.2.5 ALAD基因DNA的生物信息学分析  52-53
  3.3 ALAD基因表达特性分析  53-59
    3.3.1 最优半定量PCR程序的确定  53-54
    3.3.2 香蕉不同组织部位ALAD基因的表达特点  54-55
    3.3.3 低温胁迫下香蕉叶片ALAD基因的表达分析  55-56
    3.3.4 ALAD基因原核表达载体的获得  56-58
    3.3.5 ALAD蛋白的诱导表达  58-59
    3.3.6 低温胁迫下香蕉叶片ALAD蛋白表达特性  59
  3.4 ALAD基因遗传转化分析  59-65
    3.4.1 拟南芥逆境诱导型启动子rd29A全长的获得  59-60
    3.4.2 逆境诱导型启动子rd29A驱动的植物表达载体的获得  60-62
    3.4.3 ALAD基因植物表达载体的构建  62-63
    3.4.4 转基因拟南芥植株的获得以及低温条件下的表型鉴定  63-65
4 讨论  65-72
  4.1 香蕉ALAD基因全长的获取  65-66
  4.2 香蕉ALAD基因及编码序列的生物信息学分析  66-67
  4.3 香蕉ALAD基因表达特性分析  67-69
  4.4 香蕉ALAD基因遗传转化分析  69-72
5 结论  72-73
参考文献  73-84
致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 香蕉
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