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枇杷高频再生体系的建立及转单性结实iaaM基因的研究

作　者: 陶炼
导　师: 王永清
学　校: 四川农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枇杷 单性结实 受体系统 遗传转化 农杆菌介导 花粉管通道法
分类号: S667.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究建立了‘大五星’枇杷花药离体培养及成年植株叶片高频再生体系,采用农杆菌介导法以及花粉管通道法,将单性结实iaaM基因导入枇杷,研究结果如下：1.以‘大五星’枇杷花药为外植体,通过间接胚胎发生建立了枇杷花药培养及植株再生技术体系,结果表明：枇杷小孢子发育时期与花蕾直径存在相关性,横径为4.68mm左右、纵径为4.52mm左右的花蕾(此时枇杷花蕾处于单核靠边期)适宜用于枇杷花药胚状体的诱导；4℃低温处理2d愈伤组织诱导率最高,达69.89%；花药愈伤组织诱导的最适培养基是MS+2.4-D0.5mg/L+6-BA2.0mg/L,愈伤组织诱导率为78.33%；枇杷花药愈伤组织诱导胚状体的最适培养基为MS+ZT0.05mg/L+NAA0.01mg/L+IBA0.05mg/L,胚状体诱导率为25.69%；枇杷花药胚状体最适的增殖培养基为MS+ZT0.05mg/L+NAA0.02mg/L+IBA0.02mg/L,增殖系数达5.8；枇杷花药胚状体经4℃低温+饱和CaCl2脱水处理7天后接种于萌发培养基1/2MS+蔗糖30g/L上,胚状体成苗率最高,为78.2%；将再生植株移栽入配比为腐熟有机肥：园土：锯末=1：2：1的基质中时,组培苗移栽成活率达85.25%。2.以12年生‘大五星’枇杷幼叶为外植体,成功再生出了完整植株。重点研究了外植体表面灭菌方法、取材时间、基本培养基及植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导、增殖、芽苗分化及生根的影响,结果表明：枇杷叶片的灭菌处理以先用75%酒精处理12s,后用0.1%的升汞处理8min为宜；取材时间以春季最佳,愈伤组织启动萌发时间最快,平均为20.3天,诱导率为81.6%；适宜愈伤组织诱导的培养基是MS+BA0.5mg/L+2,4D0.5mg/L,在此培养基上,愈伤组织诱导率为89.2%；适宜愈伤组织增殖的培养基是MS+BA0.5mg/L+2,4D0.25mg/L,愈伤组织在此培养基上增殖最快,增殖系数达4.11；叶片基部的再生能力强于叶中部及叶尖；芽诱导的最适培养基配方是MS+TDZ0.8mg/L+NAA0.3mg/L+AgN030.2mg/L,芽诱导率为30.6%；芽苗增殖适宜培养基是MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+Tryptone750mg/L,增殖系数最高,为3.7；芽苗在1/2MS+NAA0.5mg/L培养基上,可获得86.92%的生根率。生根试管苗炼苗后,移栽到无菌锯末、泥炭和腐殖土(1：3：1)中,经过精心的温度和水分管理,可获得92.1%的成活率。3.以‘大五星’枇杷花药胚状体为受体材料,采用农杆菌介导法转化单性结实iaaM基因,探讨卡那霉素浓度、预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间以及乙酰丁香酮浓度等因素对遗传转化的影响。结果表明：卡那霉素最佳浓度为100mg/L,花药胚状体经预培养2-3d,农杆菌侵染15min,共培养3d,共培养基中加入AS10mg/L,最适合进行遗传转化。抗菌素选用250mg/L的头孢霉或安比西林750mg/L脱菌效果较好。采用此转化体系进行遗传转化,最终获得了16个卡那霉素抗性芽,对抗性芽次生胚进行iaaM和NPTII基因的特异性扩增检测,结果显示有9个胚系扩增出了预期目的条带,PCR阳性率为56.25%,进一步对抗性芽进行Southern杂交,结果显示其中有8个胚系出现了明显的杂交信号,表明iaaM基因已导入枇杷胚状体中,转化率约为0.5%。4.利用枇杷叶片愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间以及乙酰丁香酮浓度等因素对遗传转化的影响。结果表明：卡那霉素的最佳浓度为90mg/L,叶片愈伤组织经预培养6d,农杆菌侵染20min,在含有AS5mg/L的共培养基中共培养3d,最适合进行遗传转化；抗菌素选用300mg/L的头孢霉脱菌效果较好；采用此体系进行遗传转化,从1500块愈伤组织中最终获得了卡那霉素抗性愈伤组织124块,随机抽取8块进行iaaM和NPTII基因的PCR扩增鉴定,结果显示其中6块扩增出了预期条带,PCR阳性率为75%,进一步对抗性愈伤组织进行Southern杂交分析,结果显示其中有6块出现了明显的杂交信号,证实iaaM基因已导入枇杷愈伤组织基因组中,表明根癌农杆菌介导外源基因转化枇杷叶片的愈伤组织是完全可行的,为以后通过基因工程手段进行枇杷的遗传改良奠定了基础。5.以‘大五星’枇杷为材料,对枇杷花粉管通道法转基因技术进行探索性研究,将携带iaaM和GUS基因的Pbi121质粒DNA导入枇杷,结果表明：最佳注射时间为授粉后60h,此时花粉管已到达胚囊；采用“切除柱头+整个花柱”的方法注射外源DNA,转化率最高,为2.6%；随着注入外源DNA浓度的增加,坐果率逐渐降低,DNA浓度为500μg/ml是适宜的DNA注射浓度,坐果率为11.8%,而转化率可达3.2%。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章 文献综述  15-38
  引言  15
  1. 果树遗传转化的受体系统  15-16
  2. 果树遗传转化的方法  16-19
    2.1 农杆菌介导法  16-18
      2.1.1 农杆菌介导法在果树遗传转化中的应用  16-17
      2.1.2 影响农杆菌介导遗传转化的因素  17-18
    2.2 基因枪法  18
    2.3 花粉管通道法  18-19
    2.4 体外活体转化法  19
  3. 转基因植株的检测  19-20
  4. 枇杷转基因研究进展  20-21
  5. 单性结实的概念及利用  21-22
  6. 基因工程实现枇杷单性结实的途径  22-23
    6.1 在子房中表达调节果实发育早期的激素代谢与信号转导的基因诱导单性结实  22
    6.2 在控制花器官发育的MADS盒基因中插入转座子诱导单性结实  22-23
    6.3 在种子中表达破坏种子发育的基因诱导单性结实  23
  7. iaaM基因在单性结实基因工程中的应用  23-24
  8. 本研究的目的及意义  24-25
  9. 本研究采用的技术路线  25
  参考文献  25-38
第二章 枇杷花药胚状体高频再生体系的建立  38-57
  摘要  38-39
  1. 材料与方法  39-41
    1.1 材料  39
    1.2 方法  39-41
      1.2.1 枇杷小孢子单核期的确定  39
      1.2.2 不同低温处理对枇杷花药愈伤组织诱导的影响  39
      1.2.3 花药愈伤组织诱导  39-40
      1.2.4 胚状体的诱导  40
      1.2.5 胚状体的增殖  40
      1.2.6 胚状体的萌发成苗  40-41
      1.2.7 再生植株的炼苗移栽  41
  2. 结果与分析  41-51
    2.1 枇杷小孢子单核期的确定  41-43
    2.2 不同低温处理对枇杷花药愈伤组织诱导的影响  43
    2.3 花药愈伤组织诱导  43-45
    2.4 胚状体的诱导  45-46
    2.5 胚状体的增殖  46-47
    2.6 胚状体的萌发成苗  47-50
      2.6.1 不同预处理对胚状体萌发的影响  47-49
      2.6.2 基本培养基和蔗糖浓度对胚状体的萌发成苗的影响  49-50
    2.7 再生植株的炼苗移栽  50-51
  3. 讨论  51-53
    3.1 低温处理对枇杷花药愈伤组织诱导的影响  51-52
    3.2 激素对枇杷花药培养的影响  52
    3.3 枇杷花药胚的成苗  52-53
  参考文献  53-57
第三章 枇杷叶片再生体系的建立  57-75
  摘要  57
  1. 材料与方法  57-60
    1.1 材料  57-58
    1.2 方法  58-60
      1.2.1 外植体表面灭菌方法的筛选  58
      1.2.2 最佳取材时间的筛选  58
      1.2.3 愈伤组织的诱导  58
      1.2.4 愈伤组织的继代与增殖  58-59
      1.2.5 愈伤组织的分化  59
      1.2.6 芽苗增殖  59
      1.2.7 壮苗与生根培养  59
      1.2.8 炼苗移栽  59-60
  2. 结果与分析  60-68
    2.1 外植体表面灭菌方法的筛选  60
    2.2 最佳取材时间的筛选  60-61
    2.3 愈伤组织的诱导  61-63
    2.4 愈伤组织的增殖  63-64
    2.5 愈伤组织的分化  64-65
    2.6 芽苗的增殖  65-67
    2.7 壮苗与生根培养  67-68
    2.8 炼苗移栽  68
  3. 讨论  68-71
    3.1 愈伤组织的诱导  68-69
    3.2 愈伤组织的分化  69-70
      3.2.1 外植体的取材部位对不定芽分化的影响  69
      3.2.2 植物生长调节剂对枇杷叶片不定芽分化的影响  69-70
    3.3 生根培养  70-71
  参考文献  71-75
第四章 根癌农杆菌介导iaaM基因转化枇杷花药胚的研究  75-89
  摘要  75-76
  1. 材料与方法  76-80
    1.1 材料  76-77
      1.1.1 转化受体材料  76
      1.1.2 供试菌株与基因  76-77
      1.3.3 培养基及培养条件  77
    1.2 方法  77-79
      1.2.1 农杆菌的活化及工程菌液的制备  77
      1.2.2 卡那霉素选择压的筛选  77
      1.2.3 农杆菌介导遗传转化条件的筛选  77-78
      1.2.4 iaaM对枇杷花药胚的遗传转化及抗性胚状体的萌发  78-79
    1.2.5 转基因花药胚的分子检测  79-80
  2. 结果与分析  80-85
    2.1 卡那霉素选择压的筛选  80
    2.2 预培养时间的筛选  80-81
    2.3 农杆菌浸染时间的筛选  81
    2.4 共培养时间的确定  81
    2.5 乙酰丁香酮浓度的筛选  81-82
    2.6 脱菌培养抗菌素的筛选  82-83
    2.7 转基因胚状体的分子检测  83-85
      2.7.1 PCR检测  83-84
      2.7.2 PCR-Southern检测  84-85
    2.8 转基因胚状体的成苗  85
  3. 讨论  85-86
  参考文献  86-89
第五章 农杆菌介导iaaM基因导入枇杷叶片愈伤组织的研究  89-102
  摘要  89
  1. 材料与方法  89-92
    1.1 转化受体材料  89-90
    1.2 供试菌株与基因  90
    1.3 培养基及培养条件  90
      1.3.1 细菌培养基  90
      1.3.2 转化体系培养基  90
      1.3.3 培养条件  90
    1.4 方法  90-92
      1.4.1 农杆菌的活化及工程菌液的制备  90
      1.4.2 卡那霉素选择压的筛选  90-91
      1.4.3 农杆菌介导遗传转化条件的筛选  91-92
      1.4.4 叶片愈伤组织的遗传转化  92
      1.4.5 抗性叶片愈伤组织的检测  92
  2. 结果与分析  92-98
    2.1 叶片愈伤组织对卡那霉素的敏感性  92-93
    2.2 预培养时间对枇杷叶片愈伤组织遗传转化的影响  93-94
    2.3 浸染时间对枇杷叶片愈伤组织遗传转化的影响  94
    2.4 共培养时间对枇杷叶片愈伤组织遗传转化的影响  94
    2.5 乙酰丁香酮对枇杷叶片愈伤组织遗传转化的影响  94-95
    2.6 头孢霉素对枇杷叶片愈伤组织生长的影响  95
    2.7 抗性愈伤组织的筛选与获得  95-97
    2.8 抗性愈伤组织的检测  97-98
      2.8.1 PCR检测  97-98
      2.8.2 Southern杂交分析  98
  3. 讨论  98-100
  参考文献  100-102
第六章 花粉管通道法介导iaaM基因转化枇杷的初步研究  102-112
  摘要  102
  1. 材料与方法  102-104
    1.1 材料  102-103
      1.1.1 受体材料  102-103
      1.1.2 供体  103
    1.2 方法  103-104
      1.2.1 质粒的提取  103
      1.2.2 枇杷花粉管通道形成时间确定  103
      1.2.3 转化方法的确定  103-104
      1.2.4 DNA浓度的确定  104
      1.2.5 种子的离体培养  104
      1.2.6 GUS标记基因检测  104
  2. 结果与分析  104-108
    2.1 枇杷花粉萌发及花粉管生长观察  104-106
    2.2 转化方法的确定  106
    2.3 适宜DNA浓度的确定  106-108
  3. 讨论  108-110
  参考文献  110-112
第七章 本文创新点及下一步工作设想  112-114
  1. 创新点  112
  2. 下一步工作设想  112-114
缩略词表  114-115
致谢  115-116
攻读博士学位期间发表的论文和参加的主要学术活动  116-118

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 热带及亚热带果类 > 枇杷
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