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柑橘硼运输基因CiNIP5和CiNIP6的克隆和功能鉴定

作　者: 安吉翠
导　师: 彭抒昂
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枳 CiNIP5 CiNIP6 硼 运输 启动子 遗传转化
分类号: S666
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


柑橘是世界范围内普遍种植的一类非常重要的经济作物,而它在中国的主要种植区之一赣南的土壤中严重缺乏硼素,导致柑橘花而不实或者“猴头果”,降低了柑橘产量,从而影响果农的经济收入。硼是植物生长必需的微量元素,它在土壤中存在的主要形式是B(OH)3,并以中性分子的形式为植物所吸收和运输。植物对硼素的浓度适应范围比较窄,硼素浓度过低或过高对植物生长都会造成不利的影响。在雨水过多地方如江西赣南地区,硼素很容易被雨水淋失而使作物出现缺硼症状；而在干旱地区如澳大利亚,因灌溉水含硼量过高或者施用过量硼肥而硼在土壤中累积造成植物硼毒害。虽然硼素对作物的经济价值影响非常大,但是目前人们对硼素的代谢路径尚不清楚。近期的研究表明,植物中特有的一类水通道蛋白—NIP家族蛋白参了硼素的吸收和运输过程,NIP家族基因运输硼、甘油等大分子的功能成为研究热点。目前在拟南芥、水稻、葡萄等作物中已经克隆得到与硼吸收和运输有关的基因,但是在柑橘中还未见报道。本研究利用电子克隆、染色体步移等技术,从柑橘砧木枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]中克隆了两个基因CiNIP5和CiNIP6及他们的启动子,分析了基因编码的氨基酸序列的保守性和多样性,研究了他们在枳壳中组织特异表达模式和缺硼、硼毒害胁迫条件下的时空表达情况以及启动子区域存在的关键元件。为了进一步的证实CiNIP5和CiNIP6与硼吸收和运输的关系,还对这两个基因进行功能验证工作。本研究最终证实了柑橘中CiNIP5和CiNIP6分别参与了植株吸收和运输硼的过程,为通过转基因技术提高柑橘耐硼胁迫环境提供了理论基础。主要结果如下：1.采用同源克隆技术从柑橘砧木枳中得到硼运输基因CiNIP5,基因序列包含903bp的开放阅读框,编码300个氨基酸。预测CiNIP5编码蛋白质分子的分子量为31.0kDa,等电点为8.73。多序列比对和系统进化树分析表明,CiNIP5属于水通道蛋白家族中的NIP亚家族,与拟南芥中的AtNIP5;1有高度的相似性。生物信息学分析表明CiNIP5蛋白具有典型的NPA和Ar/R结构域,可以运输比水分子大的中性小分子物质。基因表达分析表明CiNIP5mRNA主要在枳根部表达,在茎和叶中的表达量非常低。低硼胁迫下,CiNIP5mRNA积累量显著升高；在高浓度硼胁迫下,CiNIP5mRNA积累量显著降低。2.采用同源克隆技术从柑橘砧木枳中得到硼运输相关基因CiNIP6,基因序列包含915bp的开放阅读框,此开放阅读框包含五个外显子和四个内含子,编码304个氨基酸。预测CiNIP6编码蛋白质分子的分子量为31.2kDa,等电点为8.61。多序列比对和系统进化树分析表明CiNIP6属于水通道蛋白家族中的NIP亚家族,与拟南芥中的AtNIP6;1有高度的相似性。生物信息学分析表明CiNIP6蛋白具有典型的NPA和Ar/R结构域,其中Ar/R组成为T,I,G和R不同于AtNIP6;1的结构,推测CiNIP6具有不同于AtNIP6;1的功能。基因表达分析表明CiNIP6mRNA主要在枳地上部位表达,在根中的表达量非常低。在低硼和高硼浓度胁迫下,CiNIP6mRNA积累量都显著升高,说明CiNIP6参与调节植物体内硼的平衡分布。3.应用染色体步移技术克隆得到CiNIP5和CiNIP6基因启动子。生物信息学分析表明这两个基因的启动子都具有典型的TATA box和CAAT box,并含有很多逆境响应元件；如干旱、伤害等,还包含乙烯、赤霉素、生长素、光等激素和环境信号响应元件。4.通过生物信息学分析,比对发现CiNIP5的5端UTR和AtNIP5;1的5端UTR具有很高的相似性,都具有两个保守序列：序列1(CAUGUAA)和序列2(UCAAAUCAUGUAA)。这两个序列对于CiNIP5响应环境中硼浓度而上调或下调变化起到决定性作用。5.通过转基因技术,将CiNIP5和CiNIP6基因转入烟草中超表达进行功能分析。结果表明转CiNIP5基因植株的细胞耐逆境能力增强,叶片的光合作用增强,根部累积的硼含量显著增加；转CiNIP6基因植株叶片中硼含量显著增加,但是其他生理指标和对照没有显著差异。说明CiNIP5对于植物适应硼浓度的变化有更重要的意义。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
缩略词(Abbreviations)  13-14
第一章 前言  14-33
  1 课题的提出  14-15
  2 植物硼营养研究进展  15-25
    2.1 硼的吸收和运输  16-19
      2.1.1 根对硼的吸收  16-17
      2.1.2 植物体内硼的移动性  17-19
    2.2 缺硼研究  19-22
      2.2.1 细胞壁、骨架和膜  20-21
      2.2.2 氮的固定和硝酸盐的同化作用  21
      2.2.3 次生代谢和氧化胁迫  21-22
      2.2.4 生长素运输  22
    2.3 硼毒害研究  22-24
      2.3.1 硼毒害与盐胁迫  23-24
      2.3.2 耐硼毒害机理  24
    2.4 硼素和基因表达  24-25
  3 与硼运输有关的水通道蛋白研究进展  25-29
    3.1 水通道蛋白(MIP)的分类  25
    3.2 水通道蛋白的运输机制  25-28
    3.3 NIP蛋白的结构和功能  28-29
  4 柑橘硼营养研究进展  29-31
    4.1 柑橘中硼的作用  29
    4.2 柑橘中硼的存在形式和移动性  29-30
    4.3 柑橘中硼素与钙、锌、盐的关系  30-31
      4.3.1 硼和钙  30
      4.3.2 硼和锌  30-31
      4.3.3 硼和盐  31
  5 本研究的目的和意义  31-33
第二章 枳CiNIP5基因的克隆、表达及功能分析  33-68
  1 材料与方法  33
    1.1 试验材料  33
    1.2 酶与试剂盒  33
    1.3 引物合成  33
  2 实验方法  33-48
    2.1 试验材料的准备  33-34
    2.2 枳CiNIP5基因克隆  34-39
      2.2.1 植物总RNA的抽提  34-35
      2.2.2 RNA质量检测与浓度测定  35
      2.2.3 第一链cDNA合成  35
      2.2.4 PCR扩增获得CiNIP5基因片段  35-36
      2.2.5 PCR产物的回收、纯化  36-37
      2.2.6 回收纯化的目的片段与克隆载体的连接  37
      2.2.7 大肠杆菌感受态的制备  37-38
      2.2.8 连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选  38
      2.2.9 CiNIP5基因片段测序  38
      2.2.10 序列拼接  38
      2.2.11 完整的ORF克隆  38-39
    2.3 生物信息学分析  39
    2.4 CiNIP5基因在缺硼胁迫下的表达模式分析  39-40
    2.5 枳CiNIP5基因超表达载体构建  40-43
      2.5.1 超量表达载体的构建  40-42
      2.5.2 小量法提取质粒DNA  42-43
    2.6 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化  43-45
      2.6.1 根癌农杆菌感受态的制备  43
      2.6.2 工程菌的制备  43-44
      2.6.3 试剂和培养基配制  44
      2.6.4 根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草  44-45
    2.7 转基因烟抗性植株PCR检测  45-46
      2.7.1 转基因烟草基因组DNA提取方法  45-46
      2.7.2 转基因烟草PCR检测  46
    2.8 亚细胞定位载体构建  46
    2.9 缺硼处理后T_0代转基因和野生型烟草叶片光合强度的测定  46-47
    2.10 缺硼处理后T_0代转基因和野生型烟草叶片相对电导率的测定  47
    2.11 缺硼处理后T_0代转基因和野生型烟草硼含量的测定  47
    2.12 T_1代转基因和野生型烟草的获得和筛选  47-48
  3 结果与分析  48-64
    3.1 CiNIP5基因的克隆及序列分析  48-53
      3.1.1 CiNIP5完整的ORF的克隆和分析  48
      3.1.2 CiNIP5和其他同源基因的聚类分析  48-51
      3.1.3 CiNIP5蛋白结构预测  51-53
    3.2 不同硼浓度处理柑橘砧木后CiNIP5的表达模式  53-54
      3.2.1 CiNIP5在枳壳中的表达模式  53
      3.2.2 缺硼胁迫下CiNIP5在砧木枳橙和香橙中的表达模式  53-54
    3.3 CiNIP5基因超表达载体的构建  54-56
      3.3.1 双酶切pMDNIP5和pCambia11301的结果  55
      3.3.2 T4连接酶连接pCAMBIA1301载体大片段和CiNIP5小片段  55-56
      3.3.3 pCambiall301：NIP5转化农杆菌  56
    3.4 烟草转基因植株的获得  56-58
      3.4.1 根癌农杆菌介导的烟草转化  56-57
      3.4.2 T_0代转基因烟草的PCR检测  57-58
      3.4.3 T_0代转基因烟草的半定量RT-PCR检测  58
    3.5 CiNIP5基因功能的验证  58-63
      3.5.1 T_0代转基因烟草与野生型烟草的表型差异  58-59
      3.5.2 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的硼含量  59-60
      3.5.3 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的膜透性  60-61
      3.5.4 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的光合作用  61-62
      3.5.5 T_1代转基因烟草的获得和Km抗性筛选  62-63
    3.6 CiNIP5亚细胞定位  63-64
  4 讨论  64-68
    4.1 CiNIP5基因的克隆和序列分析  64-65
    4.2 CiNIP5基因的表达分析  65
    4.3 转化模式植物验证CiNIP5基因功能  65-66
    4.4 CiNIP5促进植株不定根的发生  66-68
第三章 枳NIP6基因的克隆和表达分析  68-87
  1 材料与方法  68-69
    1.1 试验材料  68-69
    1.2 引物合成  69
  2 实验方法  69-73
    2.1 试验材料的准备  69
    2.2 枳CiNIP6基因克隆  69-70
      2.2.1 第一链cDNA合成  69
      2.2.2 PCR扩增获得CiNIP6基因片段  69-70
      2.2.3 CiNIP6 ORF在线预测  70
    2.3 生物信息学分析  70
    2.4 CiNIP6基因在缺硼胁迫下的表达模式  70
    2.5 枳叶脉石蜡切片的制作  70-73
      2.5.1 材料固定  70-71
      2.5.2 脱水  71
      2.5.3 透明  71
      2.5.4 浸蜡  71-72
      2.5.5 包埋  72
      2.5.6 切片、粘片和展片  72
      2.5.7 脱蜡与透明  72
      2.5.8 染色  72
      2.5.9 封片和烘片  72-73
    2.6 枳CiNIP6基因超表达载体构建  73
    2.7 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化  73
    2.8 转基因烟草Km抗性植株PCR检测  73
    2.9 缺硼处理后T_0代转基因和野生型烟草叶片叶绿素含量测定  73
    2.10 缺硼处理后T_0代转基因和野生型烟草叶片相对电导率和含硼量的测定  73
    2.11 T1代转基因和野生型烟草的获得和筛选  73
  3 结果与分析  73-85
    3.1 CiNIP6基因的克隆及序列分析  73-74
    3.2 CiNIP6和其他物种中NIP家族氨基酸序列比对和分析  74-75
    3.3 CiNIP6高级结构预测及亚细胞定位  75-79
    3.4 不同硼浓度处理枳壳后CiNIP6的表达模式  79-80
      3.4.1 正常条件下CiNIP6在枳壳中的表达模式  79
      3.4.2 硼胁迫条件下CiNIP6 mRNA在枳壳中表达模式  79-80
    3.5 缺硼条件下枳壳叶片结构变化  80-81
    3.6 CiNIP6基因超表达载体的构建  81-82
    3.7 烟草转基因植株的获得  82-85
      3.7.1 T_0代转基因烟草的PCR检测  82
      3.7.2 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的膜透性  82-83
      3.7.3 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的硼含量  83-84
      3.7.4 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的光合作用  84-85
      3.7.5 缺硼处理后T_0代转基因烟草与野生型烟草的表型  85
  4 讨论  85-87
    4.1 CiNIP6基因的克隆和序列分析  85-86
    4.2 CiNIP6基因的表达分析  86
    4.3 转化模式植物验证CiNIP6基因功能  86-87
第四章 枳NIP5 5'UTR序列分析、NIP5和NIP6启动子基因的克隆和生物信息学分析  87-100
  1 材料与方法  88-91
    1.1 植物材料  88
    1.2 染色体步移实验方法  88-91
      1.2.1 染色体步移文库构建  88-90
      1.2.2 CiNIP5启动子扩增  90-91
      1.2.3 CiNIP6启动子的扩增  91
    1.3 生物信息学分析  91
  2 结果与分析  91-96
    2.1 几种物种NIP5基因5'UTR间序列比对  91-92
    2.2 CiNIP5启动子序列生物信息学分析  92-93
    2.3 CiNIP6启动子序列生物信息学分析  93-96
  3. 讨论  96-100
    3.1 CiNIP5 5'UTR与CiNIP5 mRNA的硼依赖性累积  96
    3.2 CiNIP5启动子顺式作用元件特征  96-98
    3.3 CiNIP6启动子顺式作用元件特征  98
    3.4 CiNIP5和CiNIP6启动子顺式作用元件对比  98-100
参考文献  100-121
致谢  121-122
附录  122

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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