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农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化

作　者: 胡威
导　师: 邓子牛
学　校: 湖南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 金柑 糖橙 柠檬 农杆菌 光照 共培养条件
分类号: S666.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


农杆菌介导的柑橘遗传转化效率一直不高,为进一步提高柑橘的遗传转化效率,本研究以金柑、糖橙及柠檬实生苗上胚轴节间茎段为试材,比较系统地研究影响其再生及转化效率的各种因素,完善它了们的遗传转化技术体系。同时,在优化遗传转化技术体系的基础上,成功将“外源基因清除系统”(Gene-Deletor)以及“果实无核化”基因导入金柑和糖橙橙中,同时将YFP基因导入柠檬中。主要研究结果如下：1金柑再生及遗传转化技术体系的建立以35d苗龄金柑(完全暗培养)的实生苗上胚轴节间茎段为外植体,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg·L-16-BA)上培养50d左右,不定芽再生率可达到90%；切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg·L-1IBA+1g· L-1AC)上,不定芽生根率可达86%。以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗上胚轴节间茎段为遗传转化的外植体,用液体共培养培养基(MS+2mg·L-6-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1KT+20mg·L-1AS, pH=5.4)重悬农杆菌菌液至OD600=0.3后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg·L-16-BA+50mg·L-1kan+400mg·L-1cef)进行阳性芽的筛选,可获得较高的GUS阳性率。应用以上优化的遗传转化体系,成功将‘’Gene-deletor"和“果实无核化”基因导入金柑细胞中,获得23株转基因株系,转化效率可达6.07%。2糖橙遗传转化技术体系的优化以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,在共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃C共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基中,最后获得GUS阳性率为29.4%。为便于茎尖嫁接,抗性芽在伸长培养基(MS+0.2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IAA+0.2mg·L-1GA3)上诱导伸长1个月后,95%的抗性芽出现了伸长,平均伸长产度为2.3cm。抗性芽转入生根培养基(1/2MS+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+1g·L-1AC)中培养45d后可获得80.2%的生根率,根系平均长度为5.83cm。应用优化的遗传转化体系,将“果实无核化”基因导入糖橙细胞中,获得的7株转基因株系已嫁接于温室中,目前生长良好。3柠檬遗传转化体系的初步研究参照甜橙的遗传转化体系,以30d苗龄(暗培养20d后光照培养10d)的柠檬实生苗上胚轴节间茎段为外植体,农杆菌侵染时菌液OD600为0.7,侵染15min后将外植体转入共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+75mg·L-1kan+500mg·L-1cef,或MS+0.5mg·L-16-BA+10mg·L-1Basta+500mg· L-1cef, pH值5.7)中,经检测,成功将YFP基因导入柠檬细胞中,并获得5株YFP阳性芽,YFP阳性率为2.7%。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
縮略词表  8-13
第一章 前言  13-21
  1 柑橘遗传转化体系研究进展  13-14
    1.1 柑橘再生体系研究  13-14
    1.2 农杆菌介导的遗传转化体系研究  14
  2 影响柑橘遗传转化的因素  14-20
    2.1 农杆菌菌株  14-16
      2.1.1 农杆菌菌株的选择  15
      2.1.2 农杆菌对外植体的侵染力  15-16
    2.2 受体材料对转化效率的影响  16-18
      2.2.1 基因型  16
      2.2.2 外植体类型  16-17
      2.2.3 外植体的发育阶段  17
      2.2.4 外植体光照与暗培养时间  17
      2.2.5 外植体伤口渗出物  17-18
    2.3 培养条件  18-20
      2.3.1 培养基  18
      2.3.2 共培养时间和方式  18
      2.3.3 共培养基的pH值  18
      2.3.4 共培温度  18-19
      2.3.5 提高转化能力物质的加入  19-20
    2.4 其他提高转化率的方法  20
  3 本研究的目的与意义  20-21
第二章 金柑高效再生及遗传转化体系的建立  21-46
  1 材料与方法  21-28
    1.1 材料准备  21
    1.2 金柑再生体系研究  21-23
      1.2.1 再生培养基筛选  22
      1.2.2 实生苗生长过程中光照模式的研究  22
      1.2.3 不定芽生根培养基的确定  22-23
      1.2.4 不定芽通过嫁接再生成苗  23
    1.3 金柑遗传转化技术体系的建立  23-26
      1.3.1 农杆菌菌株与载体  23-24
      1.3.2 农杆菌侵染  24
      1.3.3 农杆菌生长曲线绘制  24
      1.3.4 乙酰丁香酮的添加  24
      1.3.5 共培时外植体放置方式  24
      1.3.6 农杆菌侵染条件研究  24-25
      1.3.7 农杆菌与外植体共培养条件研究  25
      1.3.8 不同农杆菌重悬液比较  25-26
    1.4 组织化学染色  26
    1.5 GUS阳性植株嫁接成苗  26
    1.6 转基因植株的分子检测  26-27
      1.6.1 PCR分子检测  26-27
      1.6.2 分子检测技术的优化  27
    1.7 数据统计及分析  27-28
  2 结果与分析  28-43
    2.1 金柑高效再生体系的建立  28-30
      2.1.1 不同再生培养基对金柑不定芽生长的影响  28
      2.1.2 不同光照和暗培养时间对再生的影响  28
      2.1.3 不同培养基对金柑生根的影响  28-30
    2.2 金柑高效遗传转化技术体系的建立  30-39
      2.2.1 EHA105农杆菌生长曲线制备  30-31
      2.2.2 抗生素敏感性试验  31-32
      2.2.3 AS不同加入时间对转化的影响  32-33
      2.2.4 外植体共培养时不同放置方式对转化的影响  33
      2.2.5 光照模式对抗性芽再生及转化的影响  33-34
      2.2.6 不同重悬液对转化的影响  34-35
      2.2.7 农杆菌的侵染条件对转化的影响  35-37
      2.2.8 农杆菌与外植体共培养条件对转化的影响  37-39
    2.3 转基因株系的获得  39-43
      2.3.1 农杆菌GUS染色  39-40
      2.3.2 抗性芽GUS组织染色  40-41
      2.3.3 部分GUS阳性株系进行PCR初步检测  41
      2.3.4 分子检测方法的优化  41-42
      2.3.5 转基因株系的表达分析  42-43
  3 讨论  43-45
  4 小结  45-46
第三章 甜橙遗传转化技术体系的优化  46-56
  1 材料与方法  46-49
    1.1 植物材料  46
    1.2 菌株与载体  46-47
    1.3 培养条件  47
      1.3.1 再生培养条件  47
      1.3.2 农杆菌转化糖  47
    1.4 不同光照时间对不定芽再生和转化的影响  47
    1.5 不同共培养条件对转化的影响  47-48
    1.6 抗性芽通过生根再生成苗  48
    1.7 抗性芽通过试管嫁接再生成苗  48
    1.8 GUS组织染色  48
    1.9 PCR分子检测  48
    1.10 数据统计及分析  48-49
  2 结果与分析  49-54
    2.1 实生苗生长过程中光照模式对其节间茎段再生及转化的影响  49-50
    2.2 共培养条件的正交试验结果分析  50-52
    2.3 GUS染色结果  52
    2.4 抗性芽通过生根再生成苗  52-53
    2.5 PCR检测结果  53-54
  3 讨论  54-55
  4 小结  55-56
第四章 柠檬遗传转化体系的初步优化  56-62
  1 材料与方法  56-58
    1.1 植物材料  56
    1.2 农杆菌菌株及载体  56-57
    1.3 柠檬再生培养基筛选  57
    1.4 抗生素浓度筛选  57
    1.5 除草剂浓度筛选  57
    1.6 农杆菌转化柠檬  57-58
    1.7 抗性芽荧光检测  58
    1.8 数据统计及分析  58
  2 结果与分析  58-60
    2.1 柠檬再生培养基筛选  58
    2.2 卡那霉素浓度筛选  58-59
    2.3 除草剂浓度筛选  59-60
    2.4 柠檬抗性芽的检测  60
  3 讨论  60-61
  4 小结  61-62
全文总结  62-63
本研究创新之处  63-64
下一步工作计划  64-65
参考文献  65-73
致谢  73-74
个人简历  74

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类 > 橘
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