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葡萄水杨酸和茉莉酸信号转导途径中4个重要基因的克隆及表达分析

作　者: 王文艳
导　师: 房经贵
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄基因克隆表达分析
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

葡萄是世界性的重要水果,也是我国重要的落叶果树之一,产量仅次于柑桔,其适应性强、结果早、效益高。随着经济的发展,人民生活水平的提高,对葡萄的需求量也越来越大,为了满足消费者的需求,培育高产、优质、高抗的葡萄品种是当前乃至将来葡萄育种面临的重要课题。随着葡萄基因组测序的顺利完成,抗病性的分子机制及其抗病信号转导途径将进一步阐明,有望分离获得一些参与调节抗病信号转导途径的关键基因,这将极大地推动培育持久、广谱抗病性葡萄品种的研究与实践。本研究结合模式植物抗病信号的研究热点,为确定葡萄中水杨酸和茉莉酸信号转导途径中基因对外源信号的反应,以‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera×V.Labrusca ’Fujiminori’)的叶片为试材,克隆了NPR1, PR1, COI1和LOXX24个基因,与其他植物同源进化关系的比较表明它们与其他植物基因的高度保守性,同时我们对SA与JA途径间的相互作用进行了初步的认识。主要研究结果如下：1.根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点,在GenBank的核酸(nr/nt)数据库中检索拟南芥的NPR1, PR1, COI1, LOX2基因序列信息,通过电子克隆的方式尽可能获得葡萄全长cDNA。并以此设计4对特异引物,并采用PCR方法对这些基因ORF区进行扩增,以cDNA为模板,在扩增基因的ORF区的设计上游引物与引物p03/p04进行PCR扩增获得了NPR1,COI1基因的3＇末端(3＇UTR区)将获得的各基因片段克隆至pMD19-T载体后转化E coli DH5α经PCR鉴定后进行序列测定。分析与多种植物同源基因的进化关系表明,几个SA、JA信号转导途径相关基因分别与不同植物的同源基因表现出较高的相似性。2.用半定量和定量PCR法研究各基因在不同激素处理后表达水平,发现PR1特异地受到SA的诱导,而施加JA后抑制其表达,LOX2特异地受到JA的诱导,施加SA后抑制其表达,SA与JA信号转导途径存在拮抗作用,上下游基因的表达情况说明PR1和LOX2可作为葡萄SA和JA信号转导途径的标记基因；葡萄中NPR1、PR1、COI1和LOX24个基因表达量的快速上升出现在6-24h; NPR1在500μM SA结合低浓度的JA处理时表达量增高,SA与JA出现协同作用,随着JA浓度的增高,这种协同逐渐不明显而出现拮抗作用,PRl与其表达情况基本一致；COIl在250μM JA结合施加低浓度SA时表达水平上升,JA与SA表现出协同作用,高浓度的SA使这种趋势减缓,LOX2中表现出低浓度促进,高浓度抑制的情况,JA响应基因LOX2具有更高的敏感度。在葡萄SA与JA信号转导途径中也可能存在着类似于双子叶植物中的协同或拮抗作用,它们之间的相对浓度决定着这种相互关系的变化。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词（Abbreviation)  10-12
引言  12-14
第一章文献综述  14-28
  1 植物的抗病性反应  14-15
    1.1 基础抗病性  14-15
    1.2 诱导性抗性  15
    1.3 非宿主抗性  15
  2 植物抗病反应中的信号分子  15-20
    2.1 Ca~(2+)  15-16
    2.2 活性氧(ROS)  16-17
    2.3 水杨酸(SA)  17-18
    2.4 茉莉酸/乙烯(JA/ET)  18-19
    2.5 一氧化氮(NO)  19
    2.6 生长素(Auxin)  19-20
  3 植物抗病防卫反应的基本信号通路  20-28
    3.1 水杨酸信号转导通路  21
    3.2 茉莉酸和乙烯信号转导通路  21-22
    3.3 SA途径和JA/ET途径的互作  22-28
      3.3.1 SA和JA/ET信号转导途径交叉对话的关键调控因子  23-28
第二章葡萄4个水杨酸、茉莉酸信号途径相关基因的克隆  28-44
  摘要  28-30
  1 材料和方法  30-37
    1.1 材料  30-31
      1.1.1 植物材料  30
      1.1.2 菌株及载体  30
      1.1.3 生化试剂  30-31
      1.1.4 引物  31
    1.2 方法  31-37
      1.2.1 引物设计  31-32
      1.2.2 葡萄总RNA的提取  32-33
      1.2.3 总RNA中DNA的消化  33
      1.2.4 cDNA第一链的合成  33-34
      1.2.5 葡萄4个SA、JA信号转导途径相关基因的ORF区扩增  34
      1.2.6 PCR产物的回收  34-35
      1.2.7 目的片段T载体的连接,转化及鉴定  35-36
      1.2.8 葡萄SA、JA信号途径相关基因NPR1和COI1 cDNA的3'RACE扩增  36-37
  2 结果与分析  37-41
    2.1 葡萄各组织总RNA提取纯度检测  38
    2.2 葡萄4个SA、JA信号转导途径相关基因的ORF区克隆结果  38
    2.3 葡萄2个SA、JA信号转导途径相关基因的3’RACE克隆结果  38-39
    2.4 葡萄NPR1、PR1、COI1和LOX2氨基酸序列分析  39-41
  3 讨论  41-44
第三章 4个葡萄水杨酸、茉莉酸信号转导途径相关基因的表达分析  44-58
  摘要  44-45
  1 材料与方法  45-48
    1.1 材料  45-46
      1.1.1 植物材料  45
      1.1.2 生化试剂  45-46
    1.2 方法  46-48
      1.2.1 实验材料处理  46-47
      1.2.2 RNA的提取与纯化  47
      1.2.3 cDNA合成  47
      1.2.4 半定量RT-PCR  47
      1.2.5 荧光定量PCR检测  47-48
      1.2.6 数据分析  48
  2 结果与分析  48-56
    2.1 葡萄总RNA提取及纯度检测  49
    2.2 几个基因的RT-PCR扩增检测  49-51
    2.3 NPR1、PR1、COI1和LOX2 4个基因的表达分析  51-56
      2.3.1 不同浓度SA和JA处理后4个基因的表达  51-54
      2.3.2 SA和JA处理后基因的时程表达  54-55
      2.3.3 SA和JA处理对彼此信号途径的影响  55-56
  3 讨论  56-58
全文总结  58-60
创新点  60-62
参考文献  62-74
附录  74-76
攻读硕士期间论文发表与投稿情况  76-78
致谢  78-79
附件  79

葡萄水杨酸和茉莉酸信号转导途径中4个重要基因的克隆及表达分析

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