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云南红皮梨PpCHS、PpDFR及PpPAL基因的克隆及其表达分析

作　者: 董娇
导　师: 周军
学　校: 西南林业大学
专　业: 植物学
关键词: 砚山红梨巍山红雪梨克隆半定量RT-PCR PpCHS PpDFR PpPAL 表达分析
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

花色素苷是黄酮类化合物，是植物重要的次生代谢产物，积累在细胞液泡中，决定花卉和果实的颜色。色泽是果实重要的外观品质，着色良好的红皮梨具有很高的商业价值。从分子生物学的角度研究花色素苷的合成调控机理具有重要意义。本研究从云南特有红皮梨砚山红梨(PyruspyrifoliaNaki)和巍山红雪梨(PyruspyrifoliaNaki)中克隆了与花色素苷生物合成相关的结构基因查尔酮合成酶(CHS)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因和苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA序列，并采用半定量RT-PCR技术，以actin基因为内参，对PpCHS与PpDFR基因在砚山红雪梨幼叶、花、果皮以及种子中的表达进行了分析。1.以砚山红梨为试验材料，采用同源克隆方法，克隆得到CHS基因的cDNA全长，命名为PpCHS，登录号为JQ060997。生物信息学分析表明：该基因cDNA全长1203bp，编码389个氨基酸。与西洋梨(Pyruscommunis)CHS基因(DQ901397)，(AY786998)，苹果(Malusdomestica)CHS基因(AB074485)，(EU872158)，(DQ026297)，(AY786996)和花楸(Sorbusaucuparia)CHS基因(DQ286037)在核苷酸水平上的同源性分别为97%，96%，95%，95%，95%，95%与96%。该基因不存在信号肽，无跨膜结构域，定位于细胞质中，肽链表现为亲水性，α-螺旋和无规则卷曲是其蛋白质二级结构中量最大的结构元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中，对编码的蛋白预测发现该基因含有CHS-like、KAS-III、BcsA等功能域。表达分析结果表明，PpCHS基因在幼叶、花、果皮和种子中均表达，但在幼叶和花中表达较强，在果皮和种子上表达微弱。2.以砚山红梨为试验材料，采用同源克隆方法，克隆得到DFR基因的cDNA全长，命名为PpDFR，序列号为JQ749637。生物信息学分析表明：PpDFR基因cDNA全长1160bp，编码347个氨基酸。与西洋梨DFR基因(AY227731)，(AY227732)，(AY227730)，苹果DFR基因(AF117268)，(AY227729)和山楂(Crataegusmonogyna)DFR基因(AY786995)在核苷酸水平上的同源性分别为99%，99%，99%，98%，98%和98%。氨基酸序列比对发现，在DFR蛋白N端存在一个NADPH结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLLEHGY”，还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVEEHQKPVYDESNWSDVEFCRSV”。该基因没有信号肽，无跨膜结构域，定位于细胞质基质中，肽链表现为亲水性。对编码的蛋白预测发现该蛋白包含一个NADB-Rossmannsupeffamily保守结构域，通过Rossmann折叠与NADPH结合。表达分析表明，PpDFR基因在砚山红梨幼叶、花、果皮及种子中均有表达。3.以巍山红雪梨为试验材料，采用同源克隆方法，克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA片段，命名为PpPAL，登录号为JQ749640。生物信息学分析表明：PpPAL长1919bp，编码628个氨基酸。与西洋梨PAL基因(DQ230992)，鸭梨(Pyrusbretschneideri)PAL基因(GU906268)，(JQ247318)，甜樱桃(Prunusavium)PAL基因(AF036948)和覆盆子(Rubusidaeus)PAL基因(AF237955)在核苷酸水平上的同源性分别为98%，95%，95%，88%和83%。氨基酸序列比对发现，在PAL序列中，包含L180、V181、L230、A231等脱氨基氨基酸残基，它们催化活性位点N234、G235、N356、D357、N358、H370、HNQDV(460-464)。PpPAL基因不存在导肽和信号肽，无跨膜结构域，定位于细胞质中，肽链表现为亲水性；α-螺旋和无规则卷曲是其蛋白质二级结构中量最大的结构元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中。对编码的蛋白预测发现该蛋白含有苯丙氨酸解氨酶-组氨酸解氨酶(PAL-HAL)和苯丙氨酸解氨酶(phe_am_lyase)。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语  9-13
引言  13-15
第一章文献综述  15-28
  1 果实花色素苷合成调控的分子机制研究进展  15-26
    1.1 果实花色素苷的生物合成途径  16
    1.2 果实花色素苷合成中的结构基因  16-22
    1.3 果实花色素苷合成中的转录调控因子  22-23
    1.4 影响果实颜色发育的环境因子  23-25
    1.5 植物激素对花色素苷生物合成的影响  25-26
  2 本研究的目的及意义  26
  3 主要研究内容及技术路线  26-28
    3.1 主要研究内容  26-27
    3.2 技术路线  27-28
第二章砚山红梨CHS基因的克隆及表达分析  28-49
  1 材料与方法  28-33
    1.1 试验材料  28-29
    1.2 试验方法  29-33
  2 结果与分析  33-46
    2.1 总RNA的提取及反转录  33
    2.2 CHS基因的克隆与序列分析  33-46
    2.3 CHS基因在砚山红梨幼叶、花、果皮及种子中的表达分析  46
  3 讨论  46-49
第三章砚山红梨DFR基因的克隆与表达分析  49-65
  1 材料与方法  49-52
    1.1 试验材料  49-50
    1.2 试验方法  50-52
  2 结果与分析  52-63
    2.1 DFR基因的克隆与核苷酸序列及相对应氨基酸序列的比对分析  52-57
    2.2 DFR蛋白的理化性质  57-58
    2.3 砚山红梨DFR蛋白的亚细胞定位、信号肽、跨膜结构和疏水性分析  58-60
    2.4 砚山红梨DFR蛋白二级和三级结构的预测分析  60-62
    2.5 砚山红梨DFR蛋白结构功能域分析  62
    2.6 DFR基因在砚山红梨幼叶、花、果皮及种子中的表达分析  62-63
  3 讨论  63-65
第四章巍山红雪梨PAL基因片段的克隆与序列生物信息学分析  65-81
  1 材料与方法  65-67
    1.1 试验材料  65-66
    1.2 试验方法  66-67
  2 结果与分析  67-79
    2.1 PAL基因序列及其所推导的氨基酸序列比对分析  67-75
    2.2 PAL蛋白的理化性质  75
    2.3 巍山红雪梨PAL蛋白的亚细胞定位、信号肽、跨膜结构和疏水性分析  75-77
    2.4 巍山红雪梨PAL蛋白二级和三级结构的预测分析  77-79
    2.5 巍山红雪梨PAL蛋白结构功能域分析  79
  3 讨论  79-81
主要研究结果  81-82
本文创新点  82-83
参考文献  83-93
附录  93-95
硕士期间发表的论文  95-97
导师简介  97-99
致谢  99

云南红皮梨PpCHS、PpDFR及PpPAL基因的克隆及其表达分析

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