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番茄耐寒种质低温胁迫下的转录组分析及相关基因功能鉴定

作　者: 刘辉
导　师: 叶志彪
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄 多毛番茄 渐渗系 低温胁迫 非生物逆境 基因芯片 脱水素 栊牛儿基栊牛儿基还原酶 NAC转录因子
分类号: S641.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


番茄CSolanum lycopersicum)属非冷驯化植物,在生长发育的各个阶段都容易遭受低温伤害。提高番茄的抗寒性可降低低温对植株及果实的伤害,延长生长周期,减少设施栽培的投入等。筛选番茄耐低温材料,培育抗寒番茄新品种具有重要的实际应用价值。CBF低温应答途径是目前研究最为清楚,也是冷驯化植物最重要的低温应答调控途径。番茄中同样存在CBF低温响应途径,但其在低温应答中发挥的作用较小。非冷驯化的番茄对低温适应的分子机制可能不同于冷驯化植物。野生多毛番茄(S. habrochaites)的抗寒性显著高于栽培番茄。过去几十年里,对多毛番茄和普通番茄在低温胁迫下的生理生化差异进行了大量研究,并取得了重要进展。但关于多毛番茄和普通番茄在低温胁迫下的基因表达差异,多毛番茄抗寒的分子机制知之甚少。本研究以多毛番茄LA1777、栽培番茄LA4024及由二者渐渗系(IL)群体为材料,对苗期植株抗寒性进行评价和筛选。为揭示番茄抗冷的分子机理,利用TOM2基因芯片对抗寒材料(供体亲本LA1777和渐渗系LA3969)和冷敏感材料(受体亲本LA4024)在低温胁迫下的基因表达差异进行了分析。根据芯片分析结果,从多毛番茄中克隆了3个抗寒相关基因,并进行了功能鉴定。主要研究结果如下：1.鉴定了多毛番茄中贡献抗寒性的染色体区段：通过比较多毛番茄LA1777和普通番茄LA4024在低温胁迫表型及相关生理指标差异,建立了番茄抗寒性鉴定体系。利用该体系对LA1777渐渗系群体幼苗进行耐低温鉴定,发现22个IL系在低温(4℃)处理3d时萎焉程度较受体亲本LA4024轻,在多毛番茄的第1、2、3、4、5、6、7、9、11及12条染色体上可能含有抗寒相关的QTLs。其中,渐渗系LA3969在整个低温处理及恢复过程中具有与供体亲本LA1777相近的表型,抗寒性显著高于受体亲本LA4024及其它IL系。低温胁迫下,LA3969和LA1777细胞膜受伤害程度较轻。低温处理10d恢复一周后,LA3969和LA1777的存活率显著高于LA4024。LA3969的抗寒性来源于导入了野生多毛番茄的第12条染色体片段。这表明在多毛番茄第12条染色体上可能含有一个或多个控制抗寒性的关键QTL/基因。2.抗/感番茄材料低温应答的分子差异：利用TOM2芯片分析了LA1777、 LA3969和LA4024幼苗在低温胁迫下的基因表达差异。低温胁迫处理3d后,在LA1777、LA3969和LA4024中分别鉴定了1613、1456和1523个低温应答基因。其中,103个低温应答基因仅在LA1777和LA3969检测到,196个低温应答基因仅在LA4024中检测到。这些基因可能在决定番茄对低温的抗或敏感性中起着重要作用。功能聚类分析表明,更多与逆境应答、内源刺激应答、信号转导、转录调控、生物合成、次生代谢、蛋白代谢等相关的基因在两抗性材料中上调表达。而更多与光合作用相关的基因在冷敏感材料中被抑制。GO (Gene Ontology)生物学进程富集分析发现更多的生物学进程在两抗性材料中被加强,而更多的生物学进程在冷敏感材料中被抑制。低温胁迫下,茉莉酸生物合成、油菜素内酯代谢过程、苯丙素生物合成、淀粉降解、亮氨酸生物合成、卡尔文循环和超氧自由基清除等7个代谢途径在抗感材料间发生了显著调整。3.番茄抗寒的分子机制：差异统计分析表明,92个基因在两抗性材料与冷敏感材料间表达变化差异显著。126个基因在LA1777中的表达变化显著不同于LA3969和LA4024。这些基因基因可能在贡献LA3969和/或LA1777的抗性中起着重要作用。对这218个差异表达基因进行染色体定位分析,发现80个基因被定位到22个筛选的抗性渐渗系染色体替换区段或已报道的多毛番茄抗寒相关QTLs区域。其中,11个位于LA3969染色体渗入的片段上,这些基因可能在贡献LA3969的抗寒性中起着重要作用。GO生物学进程富集分析表明差异表达基因中许多参与了钙信号调控、激素和ROS的动态平衡调节及信号应答。钙离子、激素及ROS作为信号分子可能在调控番茄低温应答中具有重要作用。这些信号途径在抗感材料间的调整引起下游一系基因表达的改变,包括转录因子(如HSFs、MYBs、NACs等)、翻译后修饰蛋白(如SKP2A、LAP-A1、XERICOs等)、功能蛋白(如HSPs、PRs及脱水素等)、代谢相关的酶(如GSTs、LOXs、BAM等)等。这一系列基因表达的改变使得LA1777和LA3969的抗寒性显著较LA4024提高。4.差异表达基因ShDHN的功能鉴定：根据芯片分析结果,从多毛番茄中克隆了一脱水素基因,命名为ShDHNo芯片及实时定量PCR分析表明,该基因的表达受低温胁迫诱导,且在抗性材料中的表达高于冷敏感材料。同时,该基因也受干旱、高盐、渗透胁迫、ABA和JA诱导。在普通番茄LA4024中超量表达ShDHN显著提高了植株的抗寒和抗旱性,促进了幼苗在高盐及渗透胁迫下的生长发育。同野生型相比,转基因株系在低温和干旱胁迫下积累更多的脯氨酸,具有更高的SOD和CAT活性,逆境条件下质膜的伤害程度降低。低温胁迫下,转基因株系植株叶片中H2O2和O2-的积累明显少于野生型植株。超量表达ShDHN提高了SOD1、GST和PRl的表达,降低了POD、LOX和PR2的表达。这些结果表明ShDHN可能通过提高植株在逆境条件下ROS的清除能力、促进渗透调节物质的积累、调节其它信号途径及相关基因的表达来增强植株对非生物逆境的抗性。5.差异表达基因ShCHL P的功能鉴定：根据芯片分析结果,从LA1777中克隆了一牻牛儿基牻牛儿基还原酶基因,命名为ShCHL P。组织表达谱分析表明,该基因在叶和茎中表达量较高,在根中基本不表达。干旱、高盐、低温、高温及氧化胁迫下,该基因的表达被显著抑制。我们构建了ShCHL P超量表达的载体,并转化普通番茄LA4024。在获得超量表达株系的同时,也发现了几个共抑制株系。超量表达ShCHLP提高了植株叶片叶绿素含量,促进了幼苗在正常、高盐及渗透胁迫下的生长发育；而共抑制株系植株叶片黄化,茎、叶及果实中的叶绿素含量明显降低,幼苗在高盐及渗透胁迫下的生长发育显著受到抑制。超量或抑制该基因的表达均降低了氧化胁迫对植株的伤害,导致这种表型的分子机制有待于进一步分析。这些结果表明,CHLP是植物叶绿素生物合成所必需的,该基因在植物生长发育及非生物逆境应答中起着重要作用。6.差异表达转录因子ShNAC的功能鉴定：根据芯片结果,从LA1777中克隆了一NAC转录因子,命名为ShNAC。该基因编码405个氨基酸,在其蛋白N端有一NAM保守结构域。ShNAC在LA1777各组织中呈组成型表达,以果实和花中的表达量最高,在茎中的表达最低。低温、干旱和高盐胁迫均能诱导该基因的表达。正常生长条件下,超量表达ShNAC转基因植株较野生型LA4024植株变矮,且茎基部变软,植株不能直立。超量表达ShNAC转基因植株较野生型对低温和干旱更敏感。ShNAC可能是植物生长发育及非生物逆境应答的一个负调节因子。

全文目录


目录  4-10
摘要  10-13
Abstract  13-17
縮略词表  17-18
第一章 文献综述  18-35
  1 低温胁迫对植物的影响  18-22
    1.1 低温胁迫对细胞膜系统的影响  19
    1.2 低温胁迫对植物光合作用的影响  19-20
    1.3 低温胁迫对代谢的影响  20-22
  2 植物抗寒性的鉴定方法和指标  22-23
  3 植物应答低温胁迫的分子机制  23-28
    3.1 低温胁迫信号的感知及信号传递  23-24
    3.2 植物低温应答的转录调控  24-26
      3.2.1 CBF调控途径  24-25
      3.2.2 不依赖CBF的调控途径  25-26
    3.3 转录后调控  26-28
      3.3.1 mRNA加工及由核内运出  26-27
      3.3.2 小RNA(Small RNAs)  27-28
    3.4 翻译后调控  28
  4 基因芯片技术在植物低温逆境研究中的应用  28-29
  5 利用基因工程提高植物的抗寒性  29-31
  6 番茄耐低温研究进展  31-33
  7 本研究的目的、意义及内容  33-35
第二章 耐低温IL系的筛选及低温胁迫下生理应答差异  35-48
  1 前言  35-36
  2 材料与方法  36-40
    2.1 实验材料  36
      2.1.1 植物材料  36
      2.1.2 主要试剂  36
    2.2 实验方法  36-40
      2.2.1 耐低温渐渗系的筛选  36-37
      2.2.2 电导率的测定  37
      2.2.3 MDA含量的测定  37
      2.2.4 脯氨酸含量的测定  37-38
      2.2.5 可溶性糖含量的测定  38-39
      2.2.6 SOD活性的测定  39
      2.2.7 CAT活性的测定  39
      2.2.8 APX活性的测定  39-40
      2.2.9 POD活性的测定  40
      2.2.10 叶绿素荧光参数的测定  40
      2.2.11 数据处理  40
  3 结果与分析  40-46
    3.1 耐低温渐渗系的筛选  40-43
    3.2 低温胁迫对番茄幼苗生理生化指标的影响  43-46
      3.2.1 低温胁迫对番茄幼苗细胞膜的影响  43
      3.2.2 低温胁迫对番茄幼苗可溶性溶质的影响  43-44
      3.2.3 低温胁迫对番茄幼苗PSII的影响  44-45
      3.2.4 低温胁迫对番茄幼苗抗氧化酶活性的影响  45-46
  4 讨论  46-48
第三章 抗/感番茄在低温胁迫下基因表达差异分析  48-74
  1 前言  48-49
  2 材料和方法  49-51
    2.1 实验材料  49
      2.1.1 植物材料  49
      2.1.2 主要试剂  49
      2.1.3 TOM2芯片  49
    2.2 实验方法  49-51
      2.2.1 RNA提取  49-50
      2.2.2 样品RNA荧光标记  50
      2.2.3 芯片杂交与清洗  50
      2.2.4 芯片扫描及数据分析  50
      2.2.5 生物信息学分析  50
      2.2.6 反转录  50-51
      2.2.7 实时荧光定量PCR验证  51
  3 结果分析与讨论  51-72
    3.1 低温胁迫下三材料基因表达谱的总体特征  51-53
    3.2 芯片结果的验证  53-55
    3.3 抗感材料间基因表达差异分析  55-57
    3.4 LA1777中可能贡献抗寒性的其它差异表达基因  57-58
    3.5 GO生物学进程富集分析  58-61
    3.6 钙信号途径相关基因  61
    3.7 光合相关基因  61-63
    3.8 ROS相关基因  63-64
    3.9 激素代谢与信号转导  64-66
    3.10 转录因子  66-68
    3.11 翻译后修饰  68-70
    3.12 低温胁迫下显著改变的代谢途径  70-72
  4 本章小结  72-74
第四章 差异表达基因ShDHN的功能鉴定  74-94
  1 前言  74-75
  2 材料与方法  75-78
    2.1 实验材料  75
    2.2 试剂、菌株和载体  75
    2.3 实验方法  75-78
      2.3.1 非生物逆境处理  75-76
      2.3.2 ShDHN的组织及诱导表达分析  76
      2.3.3 目标基因扩增和测序分析  76
      2.3.4 超量表达载体的构建  76
      2.3.5 番茄的遗传转化  76
      2.3.6 转基因植株的阳性检测  76
      2.3.7 转基因植株相对表达量的检测  76-77
      2.3.8 转基因植株苗期抗寒性鉴定  77
      2.3.9 转基因植株苗期抗旱性鉴定  77
      2.3.10 盐及渗透胁迫下的生长实验  77
      2.3.11 ROS组织原位检测  77-78
      2.3.12 相关生理指标的测定  78
      2.3.13 失水率的测定  78
      2.3.14 相对含水量的测定  78
  3 结果与分析  78-91
    3.1 ShDHN组织及诱导表达分析  78-80
    3.2 ShDHN的克隆及序列分析  80-82
    3.3 转基因植株的分子检测  82
    3.4 超量表达ShDHN提高了番茄的抗逆性  82-89
      3.4.1 超量表达ShDHN提高了番茄的抗寒性  82-86
      3.4.2 超量表达ShDHN提高了番茄的抗旱性  86-88
      3.4.3 超量表达ShDHN提高了幼苗对高盐及渗透胁迫的抗性  88-89
    3.5 超量表达ShDHN改变了相关基因的表达  89-91
  4 讨论  91-94
    4.1 脱水素基因的表达与植株抗性正相关  91-92
    4.2 超量表达脱水素基因降低了ROS对细胞膜的伤害  92
    4.3 脱水素基因功能的多效性  92-94
第五章 差异表达基因ShCHLP的功能鉴定  94-111
  1 前言  94-96
  2 材料和方法  96-98
    2.1 植物材料  96
    2.2 主要试剂、菌株及载体  96
    2.3 实验方法  96-98
      2.3.1 各种逆境胁迫处理  96
      2.3.2 ShCHL P组织及诱导表达谱分析  96
      2.3.3 ShCHL P的克隆及序列分析  96
      2.3.4 超量表达载体的构建及遗传转化  96-97
      2.3.5 转基因植株的分子检测  97
      2.3.6 叶盘法分析转基因植株对氧化及高盐的抗性  97
      2.3.7 叶绿素含量的测定  97
      2.3.8 高盐、渗透及氧化胁迫下的生长实验  97
      2.3.9 ROS组织原位检测  97-98
  3 结果与分析  98-108
    3.1 ShCHL P基因的克隆及序列分析  98-100
    3.2 ShCHLP的表达谱分析  100-101
    3.3 转基因株系的分子检测  101-102
    3.4 CHL P调控叶绿素的生物合成  102-103
    3.5 ShCHL P转基因植株的抗逆性分析  103-108
      3.5.1 ShCHL P转基因植株耐盐性分析  103-106
      3.5.2 ShCHL P转基因幼苗对渗透胁迫的抗性分析  106
      3.5.3 ShCHL P转基因幼苗对氧化胁迫的抗性分析  106-108
  4 讨论  108-111
    4.1 CHL P基因在植物叶绿素生物合成中的作用  108-109
    4.2 CHL P基因在植物非生物逆境应答中的作用  109-111
第六章 差异表达转录因子ShNAC的功能鉴定  111-123
  1 前言  111-113
  2 材料与方法  113-114
    2.1 植物材料  113
    2.2 主要试剂、菌株及载体  113
    2.3 实验方法  113-114
      2.3.1 ShNAC组织及诱导表达谱分析  113
      2.3.2 ShNAC基因扩增和序列分析  113
      2.3.3 超量表达载体的构建及转基因株系的分子检测  113-114
      2.3.4 转基因植株苗期抗逆性鉴定  114
      2.3.5 相关生理指标的测定  114
  3 结果与分析  114-120
    3.1 ShNAC基因的克隆及序列分析  114-116
    3.2 ShNAC组织及诱导表达谱分析  116-117
    3.3 转基因植株的抗逆性鉴定  117-120
      3.3.1 超量表达ShNAC转基因番茄植株对干旱更敏感  118-120
      3.3.2 超量表达ShNAC转基因番茄植株对低温更敏感  120
  4 讨论  120-123
    4.1 ShNAC负调控番茄的生长发育  120-121
    4.2 ShNAC负调控番茄的抗逆性  121-123
第七章 全文总结  123-125
参考文献  125-155
附录  155-167
作者简介  167-168
致谢  168

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 茄果类 > 番茄（西红柿）
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