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玉米PEPC，PPDK和NADP-ME基因在拟南芥中的表达分析

作　者: 杜西河
导　师: 许为钢
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 转基因拟南芥高光效 PEPC PPDK NADP-ME
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究利用本实验室先前克隆出来的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,GeneBank:FJ415327)，丙酮酸磷酸二激酶(PPDK, GeneBank:GU363532)和依赖NADP苹果酸酶(NADP-ME)基因转化拟南芥，从转基因后代中筛选鉴定出转单，多基因株系，初步研究了转玉米C4型高光效基因拟南芥的光合性能，并探究在干旱胁迫条件下转PEPC和PPDK基因拟南芥生理特性的变化，研究结果如下：1.利用农杆菌介导法将PEPC、PPDK和NADP-ME导入拟南芥中，通过除草剂筛选得到137棵抗性苗，PCR检测结果表明转NADP-ME、PEPC+NADP-ME、 PPDK+NADP-ME和PEPC+PPDK+NADP-ME基因拟南芥分别为23、3、9和3个株系，并通过杂交方法获得转PEPC+PPDK+NADP-ME基因株系3个。2.测定了PEPC、PPDK和NADP-ME基因7种组合方式的14个转基因株系的光合速率和叶绿素含量，其结果为：(1)6个转单基因PEPC(PC73、PC65)、PPDK(PK26、PK36)和NADP-ME(PM1、PM7)株系的净光合速率分别较对照提高8%、21%、22%、11%、14%和16%，莲座叶片叶绿素含量较对照分别提高2%、14%、25%、8%、9%和28%；(2)6个转双基因PEPC+PPDK(PCK6、PCK110)、PEPC+NADP-ME(PCM01、PCM03)和PPDK+NADP-ME(PKM03、PKM05)株系的净光合速率分别较对照提高24%、26%、26%、27%、21%和31%，莲座叶片叶绿素含量较对照分别提高27%、51%、18%、55%、45%和54%；(3)2个转三基因PEPC+PPDK+NADP-ME(PCKM01、PCKM03)株系的净光合速率分别较对照提高36%和26%，莲座叶片叶绿素含量较对照提高43%和55%。上述测定结果表明，转玉米C4途径关键酶可提高拟南芥的光合速率，相同基因型株系间存在差异，转双价基因整体上优于转单价基因，转三价基因整体上优于转双价基因。3.探究了干旱胁迫条件下转ZmPEPC与ZmPPDK基因拟南芥生理特性的变化，结果发现，在胁迫处理下，转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥幼苗的平均相对根长分别较对照增加了44%，48%和51%。干旱胁迫处理下，供试材料F0增加，Fv/Fm减小，对照F0增幅最大，为20.4%，Fv/Fm最小，为0.78；转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥株系叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量较对照增加，其中平均相对叶绿素含量分别较对照增加了13%，15%和23%；可溶性糖含量较对照增加3%，16%和24%；可溶性蛋白含量较对照增加1%，11%和15%；丙二醛含量较对照降低，分别为对照的93.5%，90.3%和84.10%；死亡率较对照降低，分别为12%，13%和7%，极显著低于对照(87%)(P<0.01)。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-8
第一章文献综述  8-21
  1.1 C_3植物与 C_4植物碳同化比较  8-10
  1.2 C_4光合途径的限速反应  10-11
  1.3 C_3植物中 C_4途径的发现  11
  1.4 C_4关键酶的特性及其转基因  11-18
    1.4.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)  13-15
    1.4.2 丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)  15-16
    1.4.3 依赖 NADP 苹果酸酶(NADP-dependent Malic Enzyme, NADP-ME)  16-17
    1.4.4 双基因及多基因共表达  17-18
  1.5 创制具有 C_4高光效性能的 C_3种质中可能存在的技术问题与分析  18
  1.6 C_3作物高光效基因工程研究发展趋势  18-19
  1.7 研究的目的意义  19
  1.8 技术路线  19-21
第二章引言  21-23
第三章材料与方法  23-27
  3.1 试验材料  23
  3.2 试验方法  23-27
    3.2.1 拟南芥转化筛选与栽培管理  23-24
      3.2.1.1 拟南芥的转化  23
      3.2.1.2 拟南芥的杂交  23-24
      3.2.1.3 阳性植株的筛选  24
      3.2.1.4 拟南芥在 1/2×MS 固体培养基上的培养  24
      3.2.1.5 拟南芥在营养土上的培养  24
    3.2.2 阳性植株的 PCR 鉴定  24-25
    3.2.3 叶绿素含量的测定  25
    3.2.4 光合速率的测定  25
    3.2.5 转基因拟南芥幼苗抗旱性鉴定  25-26
    3.2.6 转基因拟南芥成株抗旱性鉴定  26
    3.2.7 可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量的测定  26
    3.2.8 叶绿素含量及叶绿素荧光参数的测定  26
    3.2.9 数据统计分析  26-27
第四章结果与分析  27-34
  4.1 含目的基因农杆菌种 PCR 鉴定  27
  4.2 转基因拟南芥的筛选  27-28
  4.3 转基因拟南芥 PCR 鉴定  28-29
  4.4 转基因拟南芥净光合速率与叶绿素含量测定  29-30
  4.5 转基因拟南芥幼苗抗旱性鉴定  30-31
  4.6 转基因拟南芥成株抗旱性鉴定  31-32
  4.7 干旱胁迫下转基因拟南芥可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量  32
  4.8 干旱胁迫下转基因拟南芥叶绿素含量  32-34
第五章结论与讨论  34-38
  5.1 拟南芥的栽培管理  34
  5.2 转基因拟南芥的筛选与鉴定  34
  5.3 基因的表达与共表达  34-35
  5.4 光合速率与叶绿素含量的关系  35-36
  5.5 高光效基因与植物生长代谢  36-38
全文总结  38-39
参考文献  39-48
ABSTRACT  48-49

玉米PEPC，PPDK和NADP-ME基因在拟南芥中的表达分析

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