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水稻广亲和基因S5-n和光敏核不育基因pms3功能分析及作用机理研究，以及水稻Hsp20基因家族分析

作　者: 欧阳亦聃
导　师: 张启发
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 广亲和 杂种不育 光敏感雄性核不育 热激蛋白
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


水稻籼粳亚种间具有比品种间更强的杂种优势,但籼粳亚种间杂种的不育性限制了对其杂种优势的利用。在水稻中存在一类特殊的种质资源称为广亲和品种,它们分别与籼稻和粳稻杂交,其后代均表现正常可育。S5基因位于水稻第6染色体上,它是控制籼粳广亲和性状的一个主效基因。本研究的目的就是分离克隆水稻广亲和基因S5,并对该基因功能、作用机理及其参与水稻生殖隔离的调控机制做出研究。在以前的工作基础上,本研究成功分离克隆水稻广亲和基因S5,并通过RACE技术分别获得在籼稻、粳稻和广亲和品种中S5等位基因的全长cDNA。在核苷酸与蛋白水平上比较籼稻、粳稻和广亲和品种的基因结构发现籼稻和粳稻的编码区段只有两个碱基的差别,引起相应蛋白质两个氨基酸的替换。对应广亲和品种的S5等位基因（广亲和基因）蛋白N-端缺失导致功能丧失。BLASTp分析表明S5基因编码蛋白与天冬氨酸蛋白酶高度同源。来源于CERP（http://crep.ncpgr.cn/）芯片表达谱数据表明S5基因在全生育期都极低水平表达。通过RT-PCR分别检测S5基因在三个亲本幼穗发育不同时期组织中的表达量,结果表明该基因在叶片中极低水平表达而在幼穗中表达量相对较高。使用Real-time PCR对不同亲本和杂交组合F1代S5表达量进行检测,结果表明不同亲本和杂种中S5的表达差异显著。使用Real-time PCR检测S5基因在55个不同基因型材料中的表达量,并对其中13个杂交组合F1代胚囊育性做出统计。结果表明S5基因表达量与水稻品种不相关。其中杂交组合F1代材料胚囊育性和小穗育性正相关,但是和S5基因表达量不相关。这些结果表明S5基因通过控制雌配子发育影响亚种间杂种的结实率,但这种调控机制和该基因表达量高低无关。光敏感雄性核不育水稻农垦58S具有长日高温不育、短日低温可育的特点,是发展水稻“两系”法育种的重要种质资源。此前的研究中光敏感核不育基因pms3已被限定在一段28.4kb的范围内,且该范围内有且仅有一个SNP。本研究的目的就是进一步确定pms3的候选基因并对其功能和作用机制做出研究。通过生物信息学方法对目标区段进行分析,针对预测的候选基因Gene M设计引物,通过RT-PCR扩增出所对应cDNA并测序验证。进一步RT-PCR分析获得Gene M的四个转录本在58S和58N以及在长日照和短日照幼穗发育不同时期不同组织中的表达谱信息。对SNP附近序列随机设计引物扩增发现该位点上存在一个表达的EST,Gene EST。通过RACE技术获得Gene EST全长eDNA,结果表明Gene EST的5’端与Gene M中的一个转录本GENE M3的3’端部分序列重叠。通过Real-time PCR对Gene EST和GENE M3在58S和58N以及在长日照和短日照不同发育时期的幼穗中进行表达谱分析,结果表明Gene EST在幼穗6期高表达。原位杂交结果表明Gene EST和GENEM3均在幼穗中表达。这些结果为进一步确定候选基因并阐明其作用机制提供基础。Hsp20基因是植物热激蛋白家族中最大的一类家族成员,它参与热激反应和多种抗逆反应,并对许多环境因子做出应答。迄今为止,对水稻Hsp20基因的研究非常有限,且尚未有对Hsp20整个基因家族做出系统研究的报道。本研究一一列举出水稻中39个OsHsp20基因,对它们的基因结构、表达、染色体定位以及进化关系作了系统的分析,并通过RT-PCR对部分OsHsp20基因受热激诱导的反应做出研究。与此同时,本研究在三个水稻品种的25个发育时期中对OsHsp20基因进行了系统的表达聚类分析。分析结果表明OsHsp20基因在营养生长时期和生殖生长时期差异表达,且在汕优63中下降差异表达基因增加。进一步研究表明整个OsHsp20家族在汕优63中都表现出杂种优势。这些结果表明OsHsp20基因不仅在不同发育时期差异表达,在不同品种间也表现出不同的表达趋势。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略词表  13-14
第一章 水稻广亲和基因S5-n功能分析及作用机理研究  14-64
  1 文献综述  14-29
    1.1 水稻籼粳杂种不育和广亲和基因研究进展  14-23
      1.1.1 水稻籼粳杂种不育现象的提出  14-15
      1.1.2 水稻籼粳杂种不育的研究进展  15-21
        1.1.2.1 籼粳遗传分化与杂种不育的关系  15
        1.1.2.2 遗传模型的提出  15-17
        1.1.2.3 水稻籼粳亚种间杂种不育的细胞学研究  17-19
        1.1.2.4 籼粳亚种组合偏分离现象研究  19-21
      1.1.3 水稻广亲和基因研究进展  21-23
        1.1.3.1 水稻广亲和概念的提出  21
        1.1.3.2 广亲和基因的定位  21-22
        1.1.3.3 广亲和基因S5的精细定位  22-23
    1.2 植物雌配子体发育研究进展  23-28
      1.2.1 植物雌配子体的发育过程  23-25
      1.2.2 植物雌配子体发育相关基因及最新研究进展  25-28
        1.2.2.1 大孢子发生时期  25-26
        1.2.2.2 雌配子体发生时期  26-28
    1.3 研究基因表达及功能分析的实验方法  28-29
  2 本研究的目的与意义  29-30
  3 材料和方法  30-39
    3.1 获得S5候选基因ORF4和ORF5在三个亲本中的全长cDNA  30-34
      3.1.1 使用的水稻品种和材料  30
      3.1.2 RNA的提取  30-31
      3.1.3 使用RACE方法获得ORF4和ORF5的5′和3′UTR序列  31-32
        3.1.3.1 实验步骤  31
        3.1.3.2 PCR反应条件  31-32
      3.1.4 设计引物逐步延伸获得ORF4和ORF5全长cDNA序列  32-34
        3.1.4.1 cDNA的反转录  32-34
        3.1.4.2 PCR反应条件和体系  34
    3.2 表达分析  34-35
      3.2.1 材料  34
      3.2.2 RNA的提取和RT-PCR方法如前所述  34-35
    3.3 籼粳差异位点分析  35
      3.3.1 材料  35
      3.3.2 引物  35
      3.3.3 实验步骤  35
    3.4 检测ORF5在55个不同基因型材料中的表达量  35-38
      3.4.1 水稻材料  35-37
      3.4.2 实验步骤  37-38
        3.4.2.1 RNA的抽提和cDNA反转录实验步骤如前所述  37
        3.4.2.2 Real-time PCR实验步骤和反应体系  37-38
    3.5 检测杂种胚囊育性  38-39
      3.5.1 材料  38
      3.5.2 爱氏苏木精整体染色—透明法观察胚囊育性  38-39
  4 结果与分析  39-59
    4.1 获得S5候选基因ORF4和ORF5在三个亲本中的全长cDNA  39-43
      4.1.1 使用RACE方法获得ORF4的5′和3′UTR序列  39
      4.1.2 设计引物逐步延伸获得ORF4全长cDNA序列  39-41
      4.1.3 使用RACE方法获得ORF5的5′和3′UTR序列  41-42
      4.1.4 设计引物逐步延伸获得ORF5全长cDNA序列  42-43
    4.2 对ORF5的表达分析  43-51
      4.2.1 三个亲本以及Ballila和南京11杂交F_1代材料表达分析  43-47
        4.2.1.1 RNA抽提  43
        4.2.1.2 表达分析  43-47
      4.2.2 ORF5(NJ11-cDNA)转化Ballila的转基因植株T_1代材料表达分析  47-48
        4.2.2.1 RNA抽提  47-48
        4.2.2.2 表达分析  48
      4.2.3 ORF5(NJ11-cDNA)转化02428的转基因植株T_1代材料表达分析  48-50
        4.2.3.1 RNA抽提  48-49
        4.2.3.2 表达分析  49-50
      4.2.4 超表达植株表达量检测  50-51
    4.3 检测ORF5在55个基因型材料中的表达量  51-57
    4.4 对ORF4表达分析  57
    4.5 籼粳差异位点分析  57-59
  5 讨论  59-64
    5.1 ORF4和ORF5基因结构和位置探讨  59-60
    5.2 ORF4和ORF5编码蛋白讨论  60-62
    5.3 ORF4和ORF5作用模式  62-63
    5.4 小结和展望  63-64
第二章 光敏核不育基因pms3功能分析及作用机理研究  64-88
  6 文献综述  64-73
    6.1 植物雄配子体发育研究进展  64-66
      6.1.1 植物雄配子体发育过程  64-65
      6.1.2 植物雄配子体发育相关基因及最新研究进展  65-66
    6.2 水稻细胞质雄性不育研究进展  66-69
      6.2.1 水稻细胞质雄性不育机制和类型  66-67
      6.2.2 恢复基因的结构特征  67-69
    6.3 水稻光温敏雄性不育研究进展  69-72
      6.3.1 水稻光温敏雄性不育现象的发现和种质资源  69
      6.3.2 光温敏雄性不育水稻的育性转换模式与生理生化特性  69-71
      6.3.3 光温敏雄性不育基因的等位性研究与定位  71-72
    6.4 水稻基因组学及生物信息学的研究  72-73
  7 本研究的目的与意义  73-74
  8 材料和方法  74-76
    8.1 获得pms3候选基因Gene M和Gene SNP的全长cDNA及表达谱分析  74-75
      8.1.1 使用的水稻品种和材料  74
      8.1.2 RNA的提取、RT-PCR、Real-time PCR和RACE的实验步骤同第一章  74-75
    8.2 原位杂交  75-76
      8.2.1 组织切片  75
      8.2.2 原位杂交步骤  75-76
  9 结果与分析  76-84
    9.1 获得pms3候选基因Gene M和Gene SNP的全长cDNA  76-78
      9.1.1 通过RT-PCR确定Gone M的四条转录本  76-77
      9.1.2 使用RACE方法获得Gene SNP的5′和3′UTR序列  77-78
      9.1.3 Gene M和Gene SNP基因结构比较与分析  78
    9.2 表达谱分析  78-83
      9.2.1 通过RT-PCR分析Gene M的四条转录本的表达谱  78-81
      9.2.2 通过Real-time PCR分析Gene SNP和GENE M3的表达谱  81-83
    9.3 原位杂交  83-84
  10 讨论  84-88
    10.1 选择性剪切  84-85
    10.2 micro RNA  85-86
    10.3 pms3候选基因作用模式的一些思考  86-87
    10.4 前景与展望  87-88
第三章 水稻Hsp20基因家族分析  88-118
  11 文献综述  88-93
    11.1 热激蛋白概述  88-89
    11.2 热激蛋白的表达调控  89-90
    11.3 植物Hsp20家族结构及分类  90-91
      11.3.1 植物Hsp20蛋白结构  90-91
      11.3.2 植物Hsp20基因家族分类  91
    11.4 Hsp20基因的功能和最新研究进展  91-93
      11.4.1 Hsp20蛋白具有分子伴侣功能  91-92
      11.4.2 Hsp20蛋白与耐热性相关  92
      11.4.3 Hsp20基因在其他逆境胁迫中发挥作用  92-93
  12 本研究的目的与意义  93-94
  13 材料和方法  94-97
    13.1 数据库搜索  94
    13.2 基因染色体分布与基因组倍增  94-95
    13.3 基因和蛋白结构的分析  95
    13.4 进化树分析  95
    13.5 水稻OsHsp20基因热激诱导实验  95-96
    13.6 芯片表达谱分析  96-97
  14 结果与分析  97-115
    14.1 OsHsp20家族在水稻中的数量  97-98
    14.2 OsHsp20基因在染色体上的分布和基因组倍增  98-100
    14.3 OsHsp20基因和蛋白结构  100-102
    14.4 水稻和拟南芥Hsp20家族进化分析  102-104
    14.5 OsHsp20基因热激诱导分析  104-105
    14.6 OsHsp20基因芯片表达谱分析  105-108
    14.7 复制基因表达模式的分析  108-109
    14.8 杂种优势分析  109-115
  15 讨论  115-118
    15.1 热激反应  115-116
    15.2 水稻OsHsp20基因进化与功能的关系  116-117
    15.3 水稻OsHsp20基因家族都表现出杂种优势现象  117-118
参考文献  118-136
致谢  136-137
附录Ⅰ:部分试验的详细步骤  137-145
附录Ⅱ:附表1、附表2和附表3  145-152
附录Ⅲ:作者简介  152-153

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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