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水稻抗逆转录因子SNAC1靶基因的分离和功能分析
作 者: 游均
导 师: 熊立仲
学 校: 华中农业大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 非生物逆境 SNAC1靶基因 SRO PP2C
分类号: S511
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
干旱、盐碱和高温等非生物逆境对于作物的产量有着非常重要的影响。超量表达某个基因提高转基因植株抗逆性的报道已有很多,但真正能在大田生产中表现抗逆性,提高逆境条件下作物产量的报道很少。在水稻中,前人报道了一个具有显著抗逆效应的NAC转录因子——SNAC1。超表达SNAC1的转基因植株在大田干旱胁迫条件下能提高结实率,在水稻抗逆遗传改良中具有重要的应用价值。但是,SNAC1介导的逆境应答途径并不清晰,SNAC1调控气孔关闭的机制以及提高抗逆性的分子和生理基础都需要进一步的研究。本研究通过对SNAC1超表达转基因植株芯片数据的分析和筛选,鉴定了2个SNAC1靶基因OsSRO1c和OsPP18,并对这2个基因在逆境应答中的功能进行了深入的分析。通过对OsSROlc和OsPP18的功能分析,初步阐明了SNAC1调控气孔关闭的途径,明确了控制逆境胁迫下的水分散失和活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累是SNAC1超表达植株抗旱性提高的重要生理基础。主要结果如下:1. OsSRO1c是植物特有的SRO (similar to RCD one)蛋白家族成员。SNAC1能结合OsSRO1c启动子并激活OsSRO1c的表达。OsSRO1c受干旱等多种逆境和ABA (abscisic acid)等多种激素处理的诱导表达,并且在干早条件下,OsSRO1c在保卫细胞特异诱导表达。ossro1c突变体和OsSRO1c amiRNA抑制植株苗期对干旱和渗透胁迫敏感性增强。OsSRO1c超表达植株的气孔关闭数高于对照,失水速率和气孔导度显著低于对照。OsSRO1c超表达植株中H2O2的含量高于对照,并且H2O2在OsSRO1c超表达植株保卫细胞中的积累高于对照。通过调控H2O2代谢负调控气孔关闭的锌指蛋白DST及其下游基因在OsSRO1c超表达植株中的表达受到了抑制。OsSRO1c超表达植株对氧化胁迫敏感性增强,一些ROS清除酶基因的表达和ROS清除酶活性在OsSRO1c超表达植株中下降。通过酵母双杂交筛库,获得了6个OsSROlc的互作蛋白,它们可能参与了氧化胁迫抗性和气孔运动调控。2. ossro1c突变体和OsSRO1c amiRNA抑制植株成株期抗旱性增强。干旱胁迫下,突变体和amiRNA抑制植株的叶片失绿显著低于对照,结实率显著高于对照。OsSRO1c超表达植株对干旱胁迫敏感.OsSRO1c的表达随着叶片的发育衰老而升高。对ossro1c突变体进行基因表达谱分析显示,很多ROS青除相关基因的表达在ossro1c突变体中上升。ossro1c突变体和OsSRO1c amiRNA抑制植株对氧化胁迫抗性增强。ossro1c突变体中,ROS清除酶的活性高于对照,H2O2的含量低于对照。ossro1c突变体抑制了黑暗和氧化胁迫诱导的叶片衰老。负调控JA(jasmonic acid)信号的衰老延迟基因OsDOS在ossro1c突变体中的表达量升高。ossro1c突变体同样抑制了JA诱导的叶片衰老。3. OsPP18编码一个具有2C类型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶活性的PP2Cc SNAC1能结合OsPP18启动子并激活OsPP18的表达。OsPP18受干旱、高盐,低温和高温诱导表达,但是在ABA处理下OsPP18的表达没有明显变化。ospp18突变体苗期和成株期均对干旱胁迫敏感性增强。OsPP18amiRNA抑制植株对干旱和渗透胁迫敏感性增强。对osppl8突变体进行基因表达谱分析显示,很多逆境应答基因、代谢相关基因和一些ROS清除相关基因的表达在osppl8突变体中下降。osppl8突变体对氧化胁迫敏感性增强,同时ROS清除酶活性在ospp18突变体中下降oOsPP18超表达植株对渗透胁迫和氧化胁迫抗性增强。OsPP18不与SAPK (osmotic stress/ABA-activated protein kinase)互作,ospp18突变体和OsPP18超表达植株对ABA的敏感性也没有改变,表明OsPP18通过不依赖于ABA的途径参与逆境应答。
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全文目录
摘要 8-10 Abstract 10-13 缩略名词表 13-14 1 前言 14-40 1.1 植物在非生物逆境下的应答反应 14-21 1.1.1 植株和细胞水平对非生物逆境的应答反应 14 1.1.2 分子水平对非生物逆境的应答反应 14-21 1.2 ROS在植物非生物逆境应答中的作用 21-37 1.2.1 植物ROS的产生 22-26 1.2.2 植物ROS的清除机制 26-29 1.2.3 ROS在植物逆境应答中的双重作用 29-32 1.2.4 ROS与植物非生物逆境抗性 32-37 1.3 植物SRO蛋白和PP2C研究进展 37-40 1.3.1 植物SRO蛋白研究进展 37-38 1.3.2 植物PP2C研究进展 38-40 2 材料与方法 40-53 2.1 水稻材料 40 2.2 实验所用到的菌株、载体和感受态细胞 40 2.3 水稻内源基因表达量分析的材料准备 40-41 2.4 DNA抽提和突变体基因型检测 41-42 2.5 RNA抽提,反转录和实时荧光定量RT-PCR 42 2.6 遗传转化载体的构建和转化 42-44 2.7 突变体及转基因植株抗逆性分析 44-46 2.7.1 苗期抗旱性和耐盐性分析 44 2.7.2 成株期抗旱性分析 44-45 2.7.3 苗期低温和高温抗性分析 45 2.7.4 ABA敏感性分析 45 2.7.5 氧化胁迫抗性分析 45-46 2.7.6 紫外线处理抗性分析 46 2.8 转基因植株叶片气孔观测、气孔导度和保卫细胞H202检测 46 2.9 失水速率测定 46-47 2.10 氧化胁迫相关生理测定 47-48 2.10.1 MDA含量测定 47 2.10.2 叶绿素含量测定 47 2.10.3 ROS清除酶酶活测定 47-48 2.10.4 DAB染色 48 2.10.5 H_2O_2定量测定 48 2.11 ABA含量测定 48 2.12 目标蛋白的亚细胞定位分析 48-49 2.12.1 通过遗传转化分析目标蛋白的亚细胞定位 48-49 2.12.2 通过瞬时表达分析目标蛋白的亚细胞定位 49 2.12.3 逆境胁迫下目标蛋白的亚细胞定位分析 49 2.13 酵母单杂交实验 49-50 2.14 染色质免疫共沉淀 50 2.15 酵母双杂交实验 50-51 2.16 Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 51 2.17 GFP的表达观察 51 2.18 原核表达和PP2C酶活测定 51-53 3 结果与分析 53-130 3.1 SNAC1候选靶基因的确定及突变体表型初步筛选 53-58 3.2 OsSRO1c在气孔运动调控中的功能分析 58-89 3.2.1 OsSRO1c受SNAC1的直接调控 58-59 3.2.2 OsSRO1c表达模式分析 59-63 3.2.3 OsSRO1c属于SRO蛋白家族 63-66 3.2.4 ossro1c突变体的获得及鉴定 66-67 3.2.5 ossro1c-1突变体苗期抗逆性分析 67-72 3.2.6 OsSRO1c抑制表达转基因植株表型分析 72 3.2.7 OsSRO1c超表达转基因植株表型分析 72-76 3.2.8 OsSRO1c调控气孔关闭 76-81 3.2.9 OsSRO1c超表达转基因植株氧化胁迫抗性分析 81-83 3.2.10 OsSRO1c互作蛋白筛选 83-86 3.2.11 OsSRO1c亚细胞定位 86-89 3.3 OsSRO1c在干旱诱导的衰老中的功能分析 89-107 3.3.1 OsSRO1c转基因植株和突变体成株期抗旱性分析 89-91 3.3.2 OsSRO1c在衰老进程中的表达分析 91-93 3.3.3 ossro1c-1突变体抑制胁迫诱导的叶片衰老 93-96 3.3.4 ossro1c-1突变体全基因组芯片分析 96-100 3.3.5 ossro1c-1突变体干旱胁迫下ROS代谢相关分析 100-103 3.3.6 ossro1c-1突变体氧化胁迫抗性分析 103-105 3.3.7 OsSRO1c参与JA介导的叶片衰老 105-107 3.4 OsPP18功能分析 107-130 3.4.1 OsPP18受SNAC1直接调控 107-109 3.4.2 OsPP18编码PP2C 109-114 3.4.3 OsPP18表达模式分析 114 3.4.4 ospp18突变体的获得及鉴定 114 3.4.5 ospp18突变体苗期抗旱性分析 114-118 3.4.6 ospp18突变体成株期抗旱性分析 118 3.4.7 OsPP18抑制表达转基因植株表型分析 118-120 3.4.8 ospp18突变体全基因组芯片分析 120-123 3.4.9 ospp18突变体氧化胁迫抗性分析 123-125 3.4.10 OsPP18超表达转基因植株表型分析 125-127 3.4.11 OsPP18不参与ABA信号转导 127-128 3.4.12 OsPP18亚细胞定位 128-130 4 讨论 130-142 4.1 OsSRO1c基因功能的探讨 130-136 4.1.1 OsSRO1c参与气孔运动调控 130 4.1.2 OsSRO1c参与逆境诱导的衰老 130-131 4.1.3 OsSRO1c调控ROS动态平衡及其在逆境应答中的双重功能 131-133 4.1.4 OsSRO1c互作蛋白及其在逆境应答中可能的功能 133-134 4.1.5 OsSRO1c可能的生化功能 134 4.1.6 OsSRO1c与拟南芥SRO蛋白功能的比较 134-136 4.1.7 对提高水稻抗旱性策略的思考 136 4.2 OsPP18基因功能的探讨 136-139 4.2.1 OsPP18是一个参与逆境信号传导的PP2C 136-138 4.2.2 OsPP18介导的逆境应答不依赖于ABA 138 4.2.3 OsPP18通过调控ROS动态平衡介导逆境抗性 138-139 4.3 OsSRO1c和OsPP18在SNAC1介导的抗逆途径中的作用 139-140 4.4 后续工作的设想 140-142 参考文献 142-163 附录 163-177 附录Ⅰ 引物列表 163-170 附录Ⅱ 部分实验的详细操作程序 170-175 附录Ⅲ 作者简介 175-177 致谢 177
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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