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农药多残留酶联免疫分析方法研究

作　者: 闫旭
导　师: 王鸣华
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 有机磷类杀虫剂 拟烟碱类杀虫剂 宽谱多决定簇抗体 酶联免疫分析方法 化学发光酶免疫分析方法 多残留免疫分析
分类号: S481.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


有机磷类和拟烟碱类杀虫剂是农业生产中广泛使用的两类农药,主要用于防治水稻、玉米和蔬菜等作物上的害虫。这两类农药在农业生产中的不当使用已经严重危害到环境质量、农产品安全和人类健康。因此,针对这两类农药建立一种快速的、灵敏的残留分析方法具有重要的研究意义。多残留酶联免疫分析技术具有操作简便、快速,价格低廉,适宜现场监控和大量样品筛选等优点,在农药残留快速检测中发挥着重要的作用。本研究建立了三种农药多残留酶联免疫分析方法：①应用宽谱多决定簇抗体建立多残留间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA);②应用两种抗体建立多残留直接竞争酶联免疫分析方法(dc-ELISA)；③两种抗体混用建立多残留增强化学发光酶联免疫分析方法(ECL-ELISA).研究结果如下：应用宽谱多决定簇抗体建立多残留ELISA分析方法：合成对硫磷半抗原(P1)和吡虫啉半抗原(11),采用碳二亚胺法将P1和11依次与载体蛋白BSA偶联,制备得到多决定簇人工免疫原,以多决定簇免疫原免疫雄性新西兰大白兔,获得可同时识别对硫磷和吡虫啉的高亲和性宽谱多决定簇抗体。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同包被原、有机溶剂、离子强度和pH值在ic-ELISA中对抗体亲和作用的影响,确立了对硫磷和吡虫啉ic-ELISA法的工作条件。在最优工作条件下,建立方法的工作曲线,对硫磷ic-ELISA抑制曲线线性范围在0.0017～1.85mg/L,回归方程为Y=-19.785x+25.300,R2为0.9925,抑制中浓度IC50为0.056mg/L,最低检测限IC10为0.0005mg/L;吡虫啉ic-ELISA抑制反应曲线在0.11～25.70mg/L,回归方程Y=-25.418x+55.847,R2为0.9924,IC5o为1.700mg/L,最低检测限为0.0045mg/L.制备的抗体除了对氯噻啉有较大的交叉反应,与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过自来水、河水、土壤和甘蓝中的添加回收率试验验证建立的ic-ELISA分析方法的准确性,添加浓度为0.002-1.000mg/L (mg/kg),添加回收率在84.4～116.9%,变异系数为0.4～7.2%。本研究建立的ic-ELISA方法符合农药残留分析要求。应用两种抗体建立多残留dc-ELISA分析方法：通过将对硫磷抗体(Pab-P)和氯噻啉抗体(Pab-I)分别包被在酶标板的不同微孔中,建立多残留免疫分析方法。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究不同酶标抗体、有机溶剂、离子强度和pH值在dc-ELISA中对方法灵敏度的影响,确立了直接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件。在最优条件下,对硫磷的回归方程为Y=-19.895x+25.291,R2为0.988,检测范围0.0018～1.84mg/L,IC50为0.057mg/L,最低检测限为0.0005mg/L；甲基对硫磷的回归方程为Y=-23.006x+32.283,R2为0.986,检测范围0.0084～3.42mg/L, IC50为0.169mg/L,最低检测限为0.0031mg/L;氯噻啉回归方程Y=-20.587x+23.562,R2为0.974,线性范围为0.0018-1.498mg/L, IC50为0.0525mg/L,最低检测限为0.0006mg/L;吡虫啉回归方程Y=-19.776x+24.784,R2为0.991,IC50为0.053mg/L,最低检测限为0.0005mg/L,线性范围为0.0016～1.745mg/L。该方法与其他的有机磷类和拟烟碱类杀虫剂均无明显交叉。通过河水、土壤和甘蓝样品中添加回收率对建立的方法进行准确性评估。添加浓度为0.005～0.500mg/L(mg/kg),添加回收率为82.5～116.3%,变异系数为1.6～8.1%。结果显示,建立的dc-ELISA方法符合农药残留分析要求。两种抗体混用建立多残留ECL-ELISA分析方法：混合应用氯噻啉抗体和噻虫啉抗体,筛选出抗体和酶标抗原的最适工作浓度,建立了应用一条标准曲线同时分析噻虫啉和氯噻啉的化学发光酶联免疫分析方法。回归方程Y=-33.609x-13.252,相关系数R2为0.988,工作浓度范围为0.0036～0.2750mg/L,最低检测限为0.0018mg/L。为了验证建立的ECL-ELISA分析方法的准确性,进行了番茄,甘蓝和稻米的添加回收率试验,添加浓度为0.04-0.25mg/L (mg/kg),添加回收率在83.7-109%,变异系数为2.0-5.8%。在方法的准确性研究中,应用番茄实际样品检测,高效液相色谱(HPLC)结果与ECL-ELISA的结果较一致(R2=0.996)。说明所建立的ECL-ELISA方法可以用于环境样品中氯噻啉和噻虫啉的快速定性及定量分析。本研究建立了三种农药多残留酶联免疫分析方法。三种方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求,可适用于大量样品和现场样品的快速检测,为开发多残留检测试剂盒奠定了基础。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略语  12-13
第一章 文献综述  13-33
  1 农药残留检测  13-16
    1.1 农药残留研究内容与目的  13
    1.2 农药残留检测技术研究进展  13-16
  2 农药酶免疫分析方法建立  16-22
    2.1 半抗原的设计与合成  16-17
    2.2 人工抗原的制备  17-18
    2.3 抗体的制备及纯化  18-19
    2.4 分析方法的优化及可行性确证  19-22
  3 农药多残留免疫分析技术研究进展  22-29
    3.1 应用广谱抗体进行农药多残留免疫分析  23-27
    3.2 利用宽谱多决定簇抗体进行农药多残留免疫分析  27-28
    3.3 使用多种抗体进行农药多残留免疫分析  28-29
    3.4 利用双特异性单克隆抗体进行农药多残留免疫分析  29
  4 有机磷和拟烟碱农药的概述  29-30
    4.1 有机磷农药概述  29-30
    4.2 拟烟碱类杀虫剂概述  30
  5 本研究的目的和意义  30-33
第二章 多克隆特异性抗体的制备  33-45
  1 材料与方法  33-40
    1.1 材料与试剂  33-34
    1.2 半抗原的合成  34-37
    1.3 人工抗原的制备与鉴定  37-38
    1.4 多克隆抗体的制备和纯化  38-40
  2 结果与分析  40-42
    2.1 半抗原结构  40-41
    2.2 人工抗原偶联物结合比的测定  41-42
    2.3 多克隆抗体的效价  42
  3 讨论  42-45
第三章 应用宽谱多决定簇抗体建立多残留ELISA分析方法  45-59
  1 材料与方法  45-47
    1.1 材料与试剂  45
    1.2 主要仪器  45-46
    1.3 间接竞争ELISA(ic-ELISA)  46
    1.4 间接竞争ELISA分析方法优化  46-47
    1.5 标准曲线的建立和线性范围的考察  47
    1.6 交叉反应率的测定  47
    1.7 添加回收率的测定  47
  2 结果与分析  47-55
    2.1 ic-ELISA分析方法优化  47-50
    2.2 标准曲线的建立  50-51
    2.3 抗体特异性分析  51
    2.4 添加回收率的测定  51-55
  3 讨论  55-59
    3.1 ic-ELISA分析方法优化  55-56
    3.2 方法的特异性  56-57
    3.3 方法的准确度和精密度  57-59
第四章 应用两种抗体建立多残留DC-ELISA分析方法  59-71
  1 材料与方法  59-62
    1.1 材料与试剂  59
    1.2 酶标半抗原的制备  59
    1.3 直接竞争ELISA(dc-ELISA)程序  59-60
    1.4 dc-ELISA分析方法优化  60-61
    1.5 标准曲线的建立和线性范围的考察  61
    1.6 交叉反应率的测定  61
    1.7 添加回收率的测定  61-62
  2 结果与分析  62-69
    2.1 ic-ELISA分析方法优化  62-64
    2.2 标准曲线的建立  64
    2.3 抗体特异性分析  64-67
    2.4 添加回收率的测定  67-69
  3 讨论  69-71
    3.1 同源异源分析  69
    3.2 两种多残留分析方法的比较  69-71
第五章 两种抗体混用建立多残留ECL-ELISA分析方法  71-83
  1 材料与方法  71-74
    1.1 材料与试剂  71
    1.2 主要仪器  71-72
    1.3 增强型化学发光酶联免疫分析方法的建立(ECL-ELISA)  72
    1.4 数据分析  72-73
    1.5 亲和常数的测定  73
    1.6 标准曲线的建立和线性范围的考察  73
    1.7 添加回收率的测定  73
    1.8 实际样品测定  73-74
  2 结果与分析  74-81
    2.1 偶联物的鉴定  74
    2.2 亲和常数的测定  74-75
    2.3 工作浓度的优化  75-78
    2.4 多残留化学发光酶联免疫方法及标准曲线的建立  78-79
    2.5 添加回收率测定  79
    2.6 真实样品检测和HPLC验证  79-81
  3 讨论  81-83
第六章 全文结论  83-89
  1 全文总结  83-84
  2 全文讨论  84-86
    2.1 免疫分析方法条件优化  84-85
    2.2 同源异源优化  85
    2.3 三种方法的比较  85-86
  3 本论文创新点  86
  4 不足与展望  86-89
参考文献  89-97
附录  97-99
致谢  99-101
硕士学位期间发表的论文  101

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 植物化学保护理论 > 农药残毒
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