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新型抗菌蛋白E12对水稻白叶枯病原菌的抑菌作用研究

作　者: 李佳
导　师: 严成其
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: E12抗菌蛋白抑菌作用黄单胞杆菌体内表达
分类号: S435.111.47
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水稻白叶枯病是严重影响水稻产量的三大病害之一。推广抗病品种和使用农药是防治白叶枯病的主要技术措施。但是,有效抗白叶枯病基因资源的缺乏和白叶枯病原菌抗药性的增强对水稻的生产造成严重的危害。因此,寻找新的抗病基因和开发新型农药对进一步防止水稻白叶枯病具有重要意义。抗菌类多肽由于其杀菌作用机制独特,有望成为新一代“抗菌素”。新型抗菌蛋白E12对包括大肠杆菌TOPO10和铜绿假单胞菌P. aeruginosa PAO1在内的多种细菌都有良好的杀菌效果。为了研究E12抗菌蛋白对水稻黄单胞杆菌的杀菌效果,我们通过E12基因在水稻黄单胞杆菌体内表达来观察其对黄单胞杆菌的抑菌效果,通过E12转基因水稻接种实验来验证E12对黄单胞杆菌的体外抑菌效果,并尝试采用原核表达系统表达和纯化E12蛋白。主要实验结果如下：1.采用原核表达系统,将E12基因克隆进原核表达载体pGEX-6P-1,构建GST-E12融合表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG低温诱导表达产生GST-E12融合蛋白,并通过GST亲和层析纯化GST-E12蛋白,SDS-PAGE和Western blotting结果证实,GST-E12融合蛋白能在大肠杆菌原核表达系统中正确表达。2.将E12基因克隆至粘粒表达载体pHM1-30T,转化水稻黄单胞杆菌R6,获得带有E12基因的黄单胞杆菌克隆R6/E12。生长曲线和CFU点板试验表明,R6/E12菌株与对照菌株R6/30T(带有pHM1-30T质粒)相比,繁殖速度变慢,生长明显受到抑制。显微观察显示,R6/E12菌株的形态发生改变,细胞拉长,且细胞密度变小。3.将密码子优化的E12基因克隆至双元载体pZH2BiKXB,构建pZH2BiKXB-E12过表达载体,转化水稻日本晴,获得水稻的3个独立转化株系均能过量表达E12基因,转化植株的后代白叶枯病抗性仍待鉴定。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
1 文献综述  11-21
  1.1 抗菌肽的特点  11
  1.2 抗菌肽的作用机理  11-13
  1.3 抗菌肽的抗菌活性  13-16
    1.3.1 抗菌肽的生物活性  13
    1.3.2 抗菌肽的结构与杀菌活性  13-16
  1.4 抗菌肽转基因植物的研究  16-17
  1.5 水稻抗白叶枯病转基因的研究进展  17-20
    1.5.1 水稻白叶枯病  17-18
    1.5.2 病原菌对水稻的侵染  18-19
    1.5.3 水稻白叶枯病抗病基因概述  19-20
  1.6 本研究的依据和意义  20-21
2 抗菌蛋白E12的表达纯化  21-41
  2.1 前言  21-22
  2.2 材料  22-24
    2.2.1 实验菌株  22
    2.2.2 质粒和载体  22
    2.2.3 仪器设备  22
    2.2.4 生化试剂  22-23
    2.2.5 培养基及试剂  23-24
  2.3 方法  24-34
    2.3.1 E12-GST载体构建  24-29
    2.3.2 蛋白诱导表达  29-31
    2.3.3 蛋白纯化  31-34
  2.4 结果分析  34-39
    2.4.1 pGEX-6P-1-E12载体构建及鉴定  34-35
    2.4.2 最佳起始诱导浓度的确定  35-36
    2.4.3 最佳诱导时间的确定  36-37
    2.4.4 GST-E12蛋白的纯化  37-38
    2.4.5 GST-E12蛋白的Western blotting验证  38-39
  2.5 讨论  39-41
3 抗菌肽体内抑菌试验  41-53
  3.1 前言  41
  3.2 材料  41-43
    3.2.1 实验菌株  41
    3.2.2 质粒与载体  41
    3.2.3 仪器与设备  41
    3.2.4 生化试剂  41-42
    3.2.5 培养基  42-43
  3.3 方法  43-49
    3.3.1、载体构建  43-47
    3.3.2 水稻黄单胞菌(Xoo,R6)感受态细胞的制备  47-48
    3.3.3 电击转化  48
    3.3.4 黄单胞杆菌转化子PCR检测  48
    3.3.5 E12蛋白的Xoo体内抑菌试验  48-49
  3.4 结果与分析  49-51
    3.4.1 粘粒表达载体构建和黄单胞杆菌转化  49-50
    3.4.2 体内抑菌试验  50-51
    3.4.3 菌形态观察  51
  3.5 讨论  51-53
4. 抗菌蛋白E12在水稻中的表达  53-62
  4.1 前言  53
  4.2 材料  53-54
    4.2.1 植物材料  53
    4.2.2 菌株和质粒  53
    4.2.3 水稻组织培养基  53-54
  4.3 方法  54-58
    4.3.1 E12密码子优化以及人工合成  54
    4.3.2 E12基因过表达载体的构建  54-55
    4.3.3 水稻的遗传转化试验  55-56
    4.3.4 植物RNA的提取和逆转录cDNA以及半定量检测  56-58
    4.3.5 水稻的抗性鉴定  58
  4.4 实验结果  58-61
    4.4.1 转基因双元载体的构建  58-59
    4.4.2 转基因植株的验证  59-60
    4.4.3 半定量RT-PCR  60
    4.4.4 E12转基因植株的抗病性检测  60-61
  4.5 讨论  61-62
参考文献  62-69
附录  69-75
攻读学位期间发表的论文目录  75-76
致谢  76-77

新型抗菌蛋白E12对水稻白叶枯病原菌的抑菌作用研究

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