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储藏害虫米象的转录组分析及逆境对相关基因表达的影响

作　者: 刘畅
导　师: 魏兆军
学　校: 合肥工业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 米象 Solexa高通量测序转录组磷化氢高温抗性
分类号: S379.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

米象（Sitophilus oryzae），是世界经济最重要的贮藏害虫之一，隶属于鞘翅目象虫科，对粮食贮藏造成了严重的损害。米象的防治目前主要是磷化氢熏蒸，磷化氢熏蒸剂其具有杀虫毒力高、渗透作用强等特点。但是现在我国多个省、市的粮库害虫米象产生了磷化氢抗性，因此开发米象的生物技术防治及明确米象的磷化氢抗性机制就非常迫切。本文采用Solexa高通量测序技术，对米象的转录组数据进行了研究和分析，明确了抗性相关的基因片段序列，研究了磷化氢熏蒸后米象谷胱甘肽硫转移酶相关基因和抗性基因的表达变化以及高温刺激后米象热激蛋白家族相关基因的表达变化。本研究结果首次明确了米象的遗传基因信息，为进一步开展米象全基因组测序、明确米象抗性分子机制以及米象的生物防治建立了基础。运用Solexa高通量测序技术，米象转录组数据库共获得21,583,796条reads数据，共包含1,618,784,700个核苷酸序列信息，得到67,264个Contigs片段，经过拼接共获得29,093条Unigenes，经NCBI数据库BLAST比对，共有16,734（57.5%）与已知的蛋白质具有相似性。转录组中Unigenes的KEGG功能注释分析结果表明，参与泛素系统通路的相关基因是778条，占9.31%；与肽酶相关的基因是512条，占6.13%；与转录因子相关的基因是489条，占5.85%；最少的为参与万古霉素类抗生素的生物合成、聚酮糖单位合成、1,1,1-三氯-2,2-双（4-氯苯基）乙烷（DDT）的降解、芴降解这4种途径相关基因，都仅只有1条。对米象的一些功能基因家族进行分析，包括7个具有代表性的基因家族。编码谷胱甘肽硫转移酶（GST）家族基因的Unigene序列为16个，分别编码GST的Delta、Sigma、Theta、Epsilon和Zeta亚基。编码细胞色素P450家族基因的Unigene为105个，分别编码16个P450家族的成员。编码热激蛋白（HSP）、保幼激素结合蛋白（JHBP）、几丁质酶（CHI）、气味结合蛋白（OBP）和神经肽（Neuropeptide）的Unigene分别为33、24、18、23、34个。我们进一步从转录组数据中鉴定出一些米象抗性靶标相关的10个特异性基因序列，包括乙酰胆碱酯酶（AChE），氨基丁酸（GABA）受体蛋白，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）-α3、α6、α9、α10亚型，电压门控钙通道蛋白β亚型和电压门控钠离子通道蛋白等。荧光定量PCR结果显示，磷化氢熏蒸后，米象的谷胱甘肽硫转移酶相关基因的表达量总体呈上升趋势，但是上升水平明显不同；抗性相关靶标基因的表达量总体呈现下降的趋势，下降的程度也和具体基因有关。高温刺激后，米象热激蛋白家族相关基因的表达水平也呈现上升趋势，其中Hsp90、Hsp60和Hsp70基因表达量显著上升，Hsp40、Hsp10和Hsp21基因的表达量变化不大。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
致谢  9-10
缩略词表  10-13
插图清单  13
插表清单  13-14
1 前言  14-22
  1.1 转录组的研究概况  14-16
  1.2 昆虫转录组的研究进展  16-18
  1.3 米象及其防治  18-21
    1.3.1 米象及其危害  18-20
    1.3.2 米象的防治  20-21
  1.4 本课题的研究意义及研究内容  21-22
    1.4.1 本课题研究意义  21
    1.4.2 本课题研究内容  21-22
2 材料和方法  22-32
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 昆虫样品采集  22
    2.1.2 主要的实验试剂  22
    2.1.3 主要的仪器设备  22-23
  2.2 米象转录组分析  23-27
    2.2.1 米象不同发育阶段总 RNA 的提取和质量检测  23-24
    2.2.2 cDNA 文库的构建和转录组测序流程  24
    2.2.3 转录组数据的组装  24-26
    2.2.4 转录组数据库的分析  26-27
  2.3 逆境处理后米象的相关基因的定量表达分析  27-32
    2.3.1 受试米象的逆境处理  27
    2.3.2 RNA 的提取  27
    2.3.3 用 DNase I 处理去除基因组 DNA  27-28
    2.3.4 RNA 浓度测定  28
    2.3.5 引物设计  28
    2.3.6 反转录成 cDNA 的第一条链  28-29
    2.3.7 标准曲线的制作  29-30
    2.3.8 荧光定量 PCR  30-31
    2.3.9 荧光定量 PCR 结果处理与分析  31-32
3 结果与分析  32-64
  3.1 米象不同发育阶段总 RNA 的检测  32
  3.2 米象转录组原始数据以及序列拼接  32-33
  3.3 米象转录组数据的分析  33-46
    3.3.1 米象 Unigene 亲缘性分析  33-34
    3.3.2 米象 Unigene 的蛋白相邻类的聚簇分析  34-35
    3.3.3 米象 Unigene 的基因功能分类分析  35-38
    3.3.4 米象 Unigene 在细胞代谢和生物体行为中的分析  38-46
  3.4 米象抗性相关功能基因和特异性靶标酶基因分析  46-58
    3.4.1 谷胱甘肽硫转移酶相关基因  46-47
    3.4.2 细胞色素 P450 家族基因  47-51
    3.4.3 热激蛋白家族基因  51-52
    3.4.4 保幼激素结合蛋白相关基因  52-54
    3.4.5 几丁质酶相关基因  54-55
    3.4.6 气味结合蛋白相关基因  55-56
    3.4.7 神经肽相关基因  56-58
    3.4.8 抗性相关的靶标基因  58
  3.5 磷化氢熏蒸处理对米象抗性相关基因表达的影响  58-62
  3.6 高温短时刺激对米象热激蛋白相关基因表达的影响  62-64
4 结论与展望  64-66
  4.1 结论  64-65
    4.1.1 米象转录组数据的分析  64
    4.1.2 米象抗性相关功能基因和特异性靶标酶基因分析  64
    4.1.3 磷化氢熏蒸处理对米象抗性相关基因表达的影响  64-65
    4.1.4 高温短时刺激对米象热激蛋白相关基因表达的影响  65
  4.2 展望  65-66
参考文献  66-71
攻读硕士期间发表的论文  71-72
附录  72-97
  附录 1 米象转录组中鉴定的谷胱甘肽硫转移酶基因序列  72-73
  附录 2 米象转录组中鉴定的细胞色素 P450 基因序列  73-84
  附录 3 米象转录组中鉴定的热激蛋白基因序列  84-88
  附录 4 米象转录组中鉴定的保幼激素基因序列  88-90
  附录 5 米象转录组中鉴定的几丁质酶基因序列  90-92
  附录 6 米象转录组中鉴定的气味结合蛋白基因序列  92-93
  附录 7 米象转录组中鉴定的神经肽基因序列  93-96
  附录 8 米象转录组中鉴定的抗性相关靶标基因序列  96-97

储藏害虫米象的转录组分析及逆境对相关基因表达的影响

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