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VAD1 mRNA在新型隐球菌性脑膜炎诊断中的意义及其与细胞因子分泌格局的关系

作 者: 江凌
导 师: 欧启水
学 校: 福建医科大学
专 业: 临床检验诊断学
关键词: 新型隐球菌 VAD1 实时荧光定量PCR 细胞因子 Th1/ Th2
分类号: R519
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 27次
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内容摘要


目的:利用实时荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)方法检测VAD1 mRNA在新型隐球菌性脑膜炎(CNM)患者脑脊液中的表达,探讨VAD1 mRNA表达量与新型隐球菌(CN)数量、临床疗效和预后的关系,为将其应用于CN感染的诊断和疗效判断奠定基础。利用ELISA方法定量测定CNM患者的Th1/Th2细胞因子,结合其VAD1 mRNA表达量及临床表现,阐明三者之间的关系,拟从细胞因子水平探讨VAD1 mRNA的表达在CNM发生、发展中的作用以及为CNM的免疫治疗提供新的依据。方法:1.RT-FQ-PCR检测方法的建立:根据GenBank收录的新型隐球菌VAD1 mRNA全序列(AY-661864),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒pGEMT-Easy-VAD1为标准品,建立RT-FQ-PCR的定量标准曲线,并评价方法的灵敏度、特异度及重复性。2.RT-FQ-PCR法诊断效能的临床评价:利用RT-FQ-PCR法、墨汁染色法、真菌培养法及CN抗原测定法检测25例CNM组和30例对照组患者脑脊液,比较各法的诊断敏感度及特异度。3.RT-FQ-PCR法的初步临床应用:检测25例CNM患者抗真菌治疗前与治疗后脑脊液中VAD1 mRNA的表达量,分析VAD1 mRNA与CN数量、临床疗效和预后的关系。比较不同药物治疗组VAD1 mRNA的表达量的变化程度,从而评价它们CNM疗效上的差异。4.VAD1 mRNA与Th1/Th2细胞因子相关性研究:利用ELISA方法定量测定CNM患者的Th1/Th2细胞因子,结合其VAD1 mRNA表达量及临床表现,阐明三者之间的关系,确定VAD1在CNM致病和诊断中的作用,为揭示CN感染时,菌体致病与宿主防御之间所引发细胞因子分泌格局的变化,以及CN感染转归多样性的细胞免疫学和分子生物学基础。结果:1. RT-FQ-PCR检测方法的建立:成功建立了新型隐球菌VAD1 mRNA的RT-FQ-PCR检测方法。建立的标准曲线相关系数为-0.9979;检测线性范围为103~107拷贝数/μl;检测灵敏度为101拷贝数/μl;高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.65%、0.89%和1.23%;RT-FQ-PCR法检测CN的敏感度为96%,特异度为100%。2.实时荧光定量PCR法诊断效能的临床评价:利用所建立的RT-FQ-PCR检测方法检测25例隐脑组和30例对照组患者的VAD1 mRNA,结果表明实时荧光定量PCR法的敏感度为96%、特异度为100%;墨汁染色法的敏感度为72%、特异度为100%;培养法的敏感度为64%、特异度为100%;抗原测定法的敏感度为96%、特异度为96.7%。明显高于墨汁染色法(χ2=4.167,P <0.05)及真菌培养法(χ2=6.125,P <0.05),与CN抗原测定法差异无统计学意义(χ2=0,P>0.05)。3.实时荧光定量PCR法初步临床应用:3.1 25例CNM患者急性期VAD1 mRNA表达量为3.042±0.906,巩固期为2.187±0.665,定量值经对数转换后进行t检验,结果t = 4.583,P<0.01,提示急性期与巩固期VAD1 mRNA表达存在显著性差异,急性期明显高于巩固期。3.2 VAD1 mRNA与隐球菌数量、颅内压及脑脊液葡萄糖浓度具有显著相关性(P值分别为<0.01,<0.01,<0.05)。其中VAD1 mRNA与隐球菌数量、颅内压呈正相关,与脑脊液葡萄糖浓度呈负相关。3.3两性霉素B(AmB)联用5-氟胞嘧啶(5-FC)组、5-氟胞嘧啶(5-FC)联用大扶康(FCZ)组、两性霉素B(AmB)与5-氟胞嘧啶(5-FC)及大扶康(FCZ)三联合用组三组药物治疗前后VAD1 mRNA表达量差异均有统计学意义(P<0.05),其中AmB+5-FC+FCZ组P<0.01;三组间两两比较时发现,三组药物治疗前后VAD1 mRNA表达量下降程度无明显差异(P>0.05)。4. VAD1 mRNA与细胞因子分泌格局的关系CNM组患者巩固期脑脊液IFN-γ、IL-12、IL-10水平与急性期相比均有显著差异,其中巩固期IFN-γ水平显著高于急性期,IL-12和IL-10水平显著低于急性期;CNM组患者急性期脑脊液IFN-γ/ IL-10、IL-12/ IL-10水平均低于正常对照组,巩固期IFN-γ/ IL-10、IL-12/ IL-10水平显著高于急性期。VAD1 mRNA表达量与IFN-γ呈显著负相关;与IL-10呈显著正相关;与IL-12不相关。结论:1.在国内外首次建立了新型隐球菌VAD1 mRNA的实时荧光定量PCR检测方法,有较高的敏感度、特异性及较好的重复性。为进一步探索新型隐球菌VAD1基因的功能及其与隐球菌病的发生、发展的相关性提供了方法学基础。2. VAD1 mRNA表达水平与疾病严重程度相关,其可能在新型隐球菌性脑膜炎的发生、发展中起作用,并有可能成为新型隐球菌感染的基因诊断、治疗的新靶点。3. VAD1 mRNA表达水平与新型隐球菌性脑膜炎的治疗效果有关,可能为新型隐球菌的毒力和致病性判断以及隐球菌性脑膜炎诊断、疗效判断和预后判断提供新的依据。4.新型隐球菌感染以Th2应答占优势,巩固期免疫应答状态向Th1漂移,这可能是新型隐球菌发生免疫逃逸,从而导致新型隐球菌性脑膜炎发生的原因之一。VAD1作为重要的毒力决定因子,其发挥作用可能与其所致的Th偏移有关。

全文目录


英汉缩略名词对照表  4-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-16
研究内容  16-59
  第一部分:新型隐球菌VAD1 mRNA 实时荧光定量PCR 方法的建立  16-36
    一、实验材料  16-19
    二、实验方法  19-27
    三、实验结果  27-33
    四、讨 论  33-36
  第二部分:实时荧光定量PCR 检测新型隐球菌VAD1 mRNA 的临床初步应用  36-48
    一、实验材料  36-38
    二、实验方法  38-39
    三、实验结果  39-45
    四、讨论  45-48
  第三部分:新型隐球菌性脑膜炎患者IFN-γ、IL-12、IL-10的检测及其意义  48-59
    一、实验材料  48-49
    二、实验方法  49-52
    三、实验结果  52-56
    四、讨论  56-59
全文总结  59-60
参考文献  60-64
综述  64-71
致谢  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 真菌与放线菌传染病
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