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乙酸及NaCl和Na2CO3胁迫对莱茵衣藻的影响

作　者: 左照江
导　师: 王勇
学　校: 南开大学
专　业: 植物学
关键词: 非生物胁迫 莱茵衣藻 光呼吸 细胞程序性死亡 活性氧 挥发性有机化合物
分类号: X173
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目前，水体酸化已成为当今世界广为关注的环境问题之一，除无机酸外，有机酸也是引起环境酸化的重要原因，其中乙酸是有机酸的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量可高达毫摩尔水平，对藻类植物的生长具有巨大的潜在威胁。除酸化外，干旱和半干旱地区的水体由于过度蒸发而存在不同程度的盐碱化，所以藻类植物还面临着盐碱化的影响。因此，鉴于酸化和盐碱化正日趋严重，日益影响着水域生态系统平衡与环境安全，本文以单细胞模式植物莱茵衣藻为实验材料，研究了乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫对其生长的影响、与光呼吸代谢的相互关系，同时对乙酸诱导莱茵衣藻发生PCD进行了深入研究，并测定了此过程中释放的VOCs，探讨了其信号作用，此外还就NaCl和Na2CO3胁迫诱导VOCs释放以及NaCl胁迫诱导光呼吸途径产生ROS进行了研究。结果如下：1. pH5.0乙酸、300mM NaCl以及25mM、50mM和150mM Na2CO3胁迫均会引起莱茵衣藻光合色素降解，并且此种降解作用与光照条件无关。除叶绿素降解外，乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫还使莱茵衣藻的光合特性发生改变，Fv/Fm、Y（II）和ETR均发生了不同程度的降低；低强度胁迫使qP增强，而高强度胁迫则降低了qP；在一定时间内，所有胁迫处理均使NPQ增强。2.乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫均能诱导莱茵衣藻迅速产生大量的O2ˉ.和H2O2，当乙酸胁迫10min时，两种ROS含量均达到最大值；当NaCl和Na2CO3胁迫30min时，ROS含量达到最大值。在ROS含量升高的同时，细胞内SOD、POD和CAT活性也发生相应变化，其中低强度胁迫使这些酶的活性得到了不同程度的提高。3.莱茵衣藻在乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫处理后，对照株系CW-Arg及SGAT敲减株系T和A的SGAT酶活性均显著增强，Ser和Gly含量升高，并且随NaCl胁迫强度增强，酶活性进一步增强、两种氨基酸含量进一步升高。虽然在正常以及乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫条件下，T和A株系的生长状况均弱于CW-Arg，但是在胁迫条件下，T和A株系受到的影响明显大于对照株系。这表明藻类植物的光呼吸途径与其抗逆性密切相关，逆境胁迫促进藻类植物的光呼吸途径运转，而光呼吸途径受阻后，藻类植物抵抗逆境胁迫的能力明显降低。4.采用抑制剂SHAM阻断乙醇酸-醌氧化还原酶系统或MOA阻断甘氨酸脱羧酶后，莱茵衣藻细胞内Ser含量明显降低，Gly含量明显升高，这表明其光呼吸途径的正常运转已受到明显影响。在NaCl胁迫条件下，经抑制剂处理的细胞所产生的ROS均明显少于未用抑制剂处理的细胞，其中SHAM处理后ROS含量最低，这表明SHAM阻断的反应即乙醇酸生成乙醛酸可能为光呼吸途径中ROS的产生位点。由于MOA处理阻断了甘氨酸向丝氨酸的转化，因此也影响了乙醇酸转化为乙醛酸，所以其ROS产量低于对照，但高于SHAM处理。采用NaCl胁迫SGAT敲减效果较强的A株系，由于丝氨酸向甘氨酸的转化被阻断，所以其ROS产生量也明显低于对照株系CW-Arg。这些结果表明，藻类植物的光呼吸途径也会导致ROS产生，其产生位点是叶绿体中乙醇酸经乙醇酸-醌氧化还原酶系统催化形成乙醛酸的反应。5.莱茵衣藻不能直接吸收利用外源L-Ser和L-Lys，而是通过胞外脱氨氧化的方式进行利用，并且此种脱氨过程依赖于氮饥饿，同时乙酸能促进此过程的进行。莱茵衣藻可利用L-Cys作为唯一氮源，其吸收量随胞外浓度增加或饲喂时间延长而增加，并且其被动扩散吸收过程不影响细胞对L-Leu的被动扩散吸收。6. pH5.0乙酸胁迫莱茵衣藻30min后，其DNA开始降解，在胁迫6h时DNA降解为150-350bp的片段。ZnSO4处理对此降解过程具有明显的抑制作用，并且1mM ZnSO4的抑制作用明显强于0.5mM。在pH5.0乙酸胁迫1h和2h时，分别有10%和95%的莱茵衣藻细胞内出现呈TUNEL阳性染色的细胞核，在胁迫4h时所有的细胞内均出现此细胞核，这表明pH5.0乙酸可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD。7.乙酸（34.3mM）在pH5.0时可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD，而H2SO4、HCl、H3PO4、磷酸缓冲液和乳酸在pH3.0时才能诱导细胞死亡，这表明溶液酸度不是诱导PCD的主要原因，而与乙酸自身的性质有关。当溶液中含有50mM乙酸，pH为6.0时，细胞死亡；然而当乙酸浓度增加至150mM，pH为7.0时，细胞则不死亡，在此情况下，溶液中的乙酸主要以乙酸根离子形式存在，因此，细胞死亡与溶液中的乙酸根离子浓度无关，而与溶液的pH值和乙酸分子浓度同时相关。8.在pH5.0乙酸诱导莱茵衣藻发生PCD的过程中，VOCs大量释放，其中在2h时释放量最大，并且成分最多，主要包括有烷烃类、烯烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和萜烯类等34种化合物。此外，300mM NaCl和150mM Na2CO3胁迫莱茵衣藻2h也可诱导其释放大量的VOCs。乙酸和NaCl胁迫均可诱导己醛（GLVs）释放，其峰面积分别为23.49×107和3.14×107；而Na2CO3胁迫则不能诱导己醛释放，其诱导的特异性成分是3,4-二甲基-己烷和5-甲基-2-庚烯。长叶烯是此三种胁迫诱导释放的主要萜烯类化合物，其峰面积分别为5.82×107（乙酸）、3.11×107（NaCl）和4.00×107（Na2CO3）。9.将乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫诱导的莱茵衣藻VOCs通入正常生长的莱茵衣藻溶液中，其细胞生长受到明显抑制，而其叶绿素含量、Fv/Fm、H2O2含量和抗氧化酶活性均不同程度增加，这表明非生物胁迫诱导的VOCs可能具有在藻类植物间进行信息传递的作用。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-18
第一章 前言  18-55
  第一节 环境胁迫对活性氧的影响  18-26
    1.1.1 活性氧的种类与产生部位  18-19
    1.1.2 环境胁迫诱导 ROS 产生  19-23
      1.1.2.1 强光胁迫  19-20
      1.1.2.2 高温胁迫  20
      1.1.2.3 干旱胁迫  20-21
      1.1.2.4 盐胁迫  21-22
      1.1.2.5 氧胁迫  22-23
      1.1.2.6 酸化  23
    1.1.3 ROS 在植物细胞中的作用  23-26
      1.1.3.1 ROS 造成氧化损伤  23
      1.1.3.2 ROS 提高植物的防御能力  23-24
      1.1.3.3 ROS 作为细胞内的信号分子  24-25
      1.1.3.4 ROS 诱导 PCD  25-26
  第二节 环境胁迫对 ROS 清除系统的影响  26-31
    1.2.1 环境胁迫对 ROS 清除酶的影响  26-29
      1.2.1.1 清除 ROS 的酶类  26-28
      1.2.1.2 环境胁迫影响 ROS 清除酶活性  28-29
    1.2.2 环境胁迫对 ROS 非酶清除系统的影响  29-31
      1.2.2.1 ROS 的非酶清除系统  29-30
      1.2.2.2 环境胁迫影响 ROS 非酶清除系统  30-31
  第三节 环境胁迫对光合作用的影响  31-33
    1.3.1 对光合色素的影响  31
    1.3.2 对光合作用的影响  31-33
      1.3.2.1 对光合组织结构的影响  31-32
      1.3.2.2 对光合作用过程的影响  32-33
  第四节 逆境胁迫与光呼吸的关系  33-37
    1.4.1 逆境胁迫促进光呼吸途径运转  34-35
    1.4.2 光呼吸途径提高植物的抗逆性  35-37
      1.4.2.1 光呼吸途径可以减轻植物的光抑制和光氧化伤害  35-36
      1.4.2.2 光呼吸影响 GSH 合成  36
      1.4.2.3 光呼吸参与脯氨酸合成  36-37
  第五节 胁迫诱导 PCD  37-45
    1.5.1 植物 PCD 的类型  37-38
    1.5.2 PCD 的鉴定特征  38-39
    1.5.3 可诱导植物 PCD 的环境胁迫  39-42
      1.5.3.1 盐胁迫  40-41
      1.5.3.2 热胁迫  41
      1.5.3.3 药物胁迫  41-42
    1.5.4 可诱导 PCD 的细胞器  42-44
    1.5.5 Bax 抑制因子对 PCD 的抑制作用  44-45
  第六节 环境胁迫对植物挥发性有机化合物的影响  45-52
    1.6.1 诱导植物 VOCs 的胁迫条件  45-48
      1.6.1.1 生物胁迫  45-47
      1.6.1.2 非生物胁迫  47-48
    1.6.2 植物 VOCs 的生态作用  48-52
      1.6.2.1 对植食性昆虫的趋避作用  48
      1.6.2.2 引诱植食性昆虫的天敌  48-49
      1.6.2.3 影响种子萌发和幼苗生长  49-51
      1.6.2.4 诱导防御  51
      1.6.2.5 避免资源竞争  51-52
  第七节 本研究的目的和意义  52-55
第二章 实验材料与方法  55-68
  第一节 材料培养与处理  55-59
    2.1.1 实验材料  55
    2.1.2 材料培养  55-56
    2.1.3 实验处理  56-59
      2.1.3.1 乙酸及 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫处理  56
      2.1.3.2 ZnSO_4处理对 DNA 降解的影响  56-57
      2.1.3.3 pH5.0 乙酸直接处理莱茵衣藻 DNA  57
      2.1.3.4 不同酸胁迫处理  57
      2.1.3.5 不同浓度乙酸在不同 pH 值条件下胁迫处理  57
      2.1.3.6 L-Ser 对乙酸胁迫下莱茵衣藻生长的影响  57
      2.1.3.7 莱茵衣藻对 L-Ser 等 5 种氨基酸的吸收  57-58
      2.1.3.8 莱茵衣藻对 L-Cys 的被动吸收  58
      2.1.3.9 莱茵衣藻 VOCs 处理  58-59
  第二节 实验方法  59-66
    2.2.1 细胞密度计算  59
    2.2.2 ROS 含量测定  59-61
      2.2.2.1 O－.2含量测定  60
      2.2.2.2 H_2O_2含量测定  60
      2.2.2.3 总 ROS 含量测定  60-61
    2.2.3 保护酶活性测定  61-62
      2.2.3.1 SOD 活性测定  61-62
      2.2.3.2 POD 活性测定  62
      2.2.3.3 CAT 活性测定  62
    2.2.4 光合色素吸收光谱及含量测定  62-63
      2.2.4.1 光合色素吸收光谱测定  62-63
      2.2.4.2 光合色素含量测定  63
    2.2.5 叶绿素荧光的测定  63
    2.2.6 莱茵衣藻光合速率和呼吸速率的测定  63
    2.2.7 莱茵衣藻 DNA 提取及测定  63-64
    2.2.8 TUNEL 染色鉴定莱茵衣藻细胞凋亡  64
    2.2.9 莱茵衣藻 VOCs 收集及其成分测定  64-65
    2.2.10 氨基酸含量分析  65-66
    2.2.11 SGAT 酶活性测定  66
  第三节 数据处理  66-68
第三章 结果与分析  68-136
  第一节 乙酸胁迫对莱茵衣藻生长的影响  68-88
    3.1.1 乙酸胁迫对莱茵衣藻细胞增殖的影响  68
    3.1.2 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合作用的影响  68-75
      3.1.2.1 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合色素的影响  68-73
        3.1.2.1.1 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合色素吸收光谱的影响  68-70
        3.1.2.1.2 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合色素导数光谱的影响  70-72
        3.1.2.1.3 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合色素含量的影响  72-73
      3.1.2.2 乙酸胁迫对莱茵衣藻光合特性的影响  73-75
    3.1.3 乙酸胁迫对莱茵衣藻呼吸速率的影响  75-76
    3.1.4 乙酸胁迫对莱茵衣藻 ROS 代谢的影响  76-78
      3.1.4.1 乙酸胁迫诱导莱茵衣藻 ROS 产生  76
      3.1.4.2 乙酸胁迫对莱茵衣藻抗氧化酶活性的影响  76-78
    3.1.5 乙酸胁迫与莱茵衣藻光呼吸代谢的关系  78-88
      3.1.5.1 乙酸胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系生长的影响  78-79
      3.1.5.2 乙酸胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系 SGAT 酶活性的影响  79-80
      3.1.5.3 乙酸胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系氨基酸含量的影响  80-81
      3.1.5.4 外源 L-Ser 对乙酸胁迫下莱茵衣藻生长的影响  81-82
      3.1.5.5 莱茵衣藻对胞外 L-Ser 等氨基酸的吸收  82-88
        3.1.5.5.1 胞外氨基酸含量变化  82-84
        3.1.5.5.2 胞内氨基酸含量变化  84-86
        3.1.5.5.3 莱茵衣藻对 L-Cys 的被动吸收  86
        3.1.5.5.4 L-Cys 对 L-Leu 吸收的影响  86-88
  第二节 乙酸胁迫诱导莱茵衣藻发生 PCD 并释放 VOCs  88-104
    3.2.1 乙酸胁迫诱导莱茵衣藻发生 PCD  88-95
      3.2.1.1 乙酸胁迫引起莱茵衣藻 DNA 降解  88-90
      3.2.1.2 TUNEL 检测莱茵衣藻细胞 PCD 过程  90-91
      3.2.1.3 乙酸诱导莱茵衣藻发生 PCD 的作用机制  91-95
        3.2.1.3.1 乙酸与其他酸引起莱茵衣藻死亡的差异  91-93
        3.2.1.3.2 莱茵衣藻对乙酸的吸收利用方式  93
        3.2.1.3.3 不同浓度乙酸对莱茵衣藻的影响  93-95
    3.2.2 莱茵衣藻 PCD 过程中释放 VOCs 及其信号作用  95-104
      3.2.2.1 莱茵衣藻 PCD 过程中 VOCs 的动态释放  95-100
      3.2.2.2 莱茵衣藻 PCD 过程中释放 VOCs 的信号作用  100-104
        3.2.2.2.1 VOCs 对莱茵衣藻细胞密度的影响  100
        3.2.2.2.2 VOCs 对莱茵衣藻叶绿素含量的影响  100-101
        3.2.2.2.3 VOCs 对莱茵衣藻 Fv/Fm 的影响  101-102
        3.2.2.2.4 VOCs 对莱茵衣藻 H_2O_2含量的影响  102
        3.2.2.2.5 VOCs 对莱茵衣藻抗氧化酶活性的影响  102-104
  第三节 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻的影响  104-136
    3.3.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻生长的影响  104-127
      3.3.1.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻细胞增殖的影响  104
      3.3.1.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻光合作用的影响  104-114
        3.3.1.2.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻光合色素的影响  105-111
        3.3.1.2.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻光合特性的影响  111-114
      3.3.1.3 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻 ROS 代谢的影响  114-118
        3.3.1.3.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻产生 ROS  114-116
        3.3.1.3.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻抗氧化酶活性的影响  116-118
      3.3.1.4 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫与莱茵衣藻光呼吸代谢的关系  118-127
        3.3.1.4.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系生长的影响  118-121
        3.3.1.4.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系 SGAT 酶活性的影响  121
        3.3.1.4.3 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对莱茵衣藻 SGAT 敲减株系氨基酸含量的影响  121-123
        3.3.1.4.4 NaCl 胁迫诱导莱茵衣藻光呼吸途径产生 ROS  123-127
    3.3.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻 DNA 降解  127-129
      3.3.2.1 NaCl 胁迫诱导莱茵衣藻 DNA 降解  127-128
      3.3.2.2 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻 DNA 降解  128-129
    3.3.3 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻释放 VOCs 及其信号作用  129-136
      3.3.3.1 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻释放 VOCs  129-132
      3.3.3.2 NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导莱茵衣藻 VOCs 的信号作用  132-136
第四章 讨论  136-148
  第一节 乙酸、NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导 ROS 产生与清除  136-139
  第二节 乙酸、NaCl 和 Na_2CO_3胁迫对光合色素和光合作用的影响  139-140
  第三节 乙酸、NaCl 和 Na_2CO_3胁迫与光呼吸代谢的关系  140-142
  第四节 莱茵衣藻对外源氨基酸的吸收利用  142-143
  第五节 乙酸诱导 PCD 及其作用机制  143-145
  第六节 乙酸、NaCl 和 Na_2CO_3胁迫诱导 VOCs 释放及其信号作用  145-148
参考文献  148-180
致谢  180-181
附录  181-186
个人简历  186-188

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境植物学
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