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盐胁迫下酿酒酵母生理生化特性的研究

作　者: 王继花
导　师: 薛永常
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母盐胁迫氯化钠渗透调节分泌蛋白
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

酵母是一种理想的真核模式生物，为广泛用于工业生产的生物材料。细胞在其自然栖息环境中和工业培养过程中，常常要忍受高盐、高糖渗透胁迫。为了揭示盐胁迫对酵母的作用，本文以酿酒酵母2144为出发菌，氯化钠作为渗透调节剂。研究了盐胁迫对酵母细胞生长、形态结构和代谢的影响，希望对相关工业生产提供理论依据。1．酵母细胞经NaCl处理后，菌落生长明显受抑制，细胞的活细胞数和生长密度均显著降低；在0.3mol/L NaCl作用下，细胞到达稳定期的时间与对照基本一致；而在0.6mol/L和1.0mol/L NaCl作用下，细胞生长缓慢，对数期延长；随着NaCl浓度的依次升高，细胞收缩，菌落数依次递减；葡萄糖消耗速率减慢；发酵结束后pH值降低。2.分析了NaCl胁迫下酵母胞内蛋白质的变化规律。在各种浓度的NaCl胁迫下酵母细胞均出现了相对分子质量为53kDa的蛋白质，随着NaCl浓度的升高该蛋白延迟表达。在添加0.3mol/L NaCl和0.6mol/L NaCl胁迫下，培养到10h时均出现两条蛋白谱带其分子量依次为61kDa和65kDa。3.分析了酵母细胞对Na+的吸收特征。随着NaCl浓度的依次升高，胞内Na+呈升高趋势而K+的含量呈下降趋势；Na+/K+比升高且在胁迫条件下的Na+/K+明显高于对照组。4.研究并发现海藻糖、甘油与酵母耐NaCl机制有关。酵母菌株在NaCl胁迫下胞内海藻糖含量明显高于对照组。随着NaCl浓度的增加，胞内甘油含量有着明显的增加。在不同盐胁迫浓度下，酵母胞外甘油的含量均随着胁迫时间的延长，呈现出先上升后下降的变化趋势。5.经Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析分离盐胁迫下酵母分泌蛋白可得出：当酵母细胞培养至8h时，无论是对照组还是胁迫组均在30管附近出现峰值管；胁迫组均在40管附近又出现峰值，而对照组则未出现。当酵母细胞培养至16h时，各组均在28管、42管附近出现峰值管；对照组和添加0.3mol/L NaCl的胁迫组均在11管出现峰值，而在添加0.6mol/L NaCl和1.0mol/L NaCl的胁迫组未出现；添加0.3mol/LNaCl的胁迫组在57管出现峰值管而对照组和其它两个浓度的胁迫组均未出现。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-24
  1.1 渗透应激对酿酒酵母的影响  11-12
    1.1.1 渗透作用  11-12
    1.1.2 环境渗透压对酿酒酵母生存的影响  12
  1.2 酿酒酵母对渗透胁迫的感应机制  12-13
    1.2.1 酿酒酵母对高渗胁迫的感应机制  12-13
    1.2.2 酿酒酵母对低渗胁迫的感应机制  13
  1.3 酵母的盐胁迫应答的信号传导途径  13-15
    1.3.1 高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶途径  13-14
    1.3.2 依赖于 Ca~(2+)/CaM 的钙调磷酸酶  14
    1.3.3 环腺-磷蛋白激酶 A 途径  14-15
    1.3.4 雷帕酶素靶分子信号途径  15
  1.4 盐胁迫应答分子机制  15-17
    1.4.1 离子平衡机制  15-16
    1.4.2 Na~+平衡  16
    1.4.3 Ca~(2+)平衡  16-17
  1.5 酵母抗渗透应激的可能机理  17-21
    1.5.1 主要渗透保护性物质的合成  17-20
      1.5.1.1 甘油  17-18
      1.5.1.2 海藻糖  18-20
    1.5.2 影响抗渗透应激的因素  20-21
      1.5.2.1 细胞周期与兼容溶质  20
      1.5.2.2 液泡  20-21
  1.6 微生物胁迫蛋白研究进展  21-22
    1.6.1 胁迫条件下的微生物蛋白质组学  21
    1.6.2 全局调控网络  21-22
    1.6.3 盐胁迫反应的蛋白质研究  22
  1.7 本研究的目的、意义及主要内容  22-24
第二章盐胁迫下酿酒酵母生理特性的变化  24-39
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 菌株  24
    2.1.2 培养基  24-25
  2.2 实验仪器  25
  2.3 实验药品  25-26
  2.4 实验方法  26-31
    2.4.1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定  26
    2.4.2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长情况观察  26
    2.4.3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定  26-27
    2.4.4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定  27-28
      2.4.4.1 二硝基水杨酸的配制  27
      2.4.4.2 葡萄糖标准曲线的绘制  27-28
      2.4.4.3 葡萄糖含量的测定  28
    2.4.5 盐胁迫下发酵 pH 值的测定  28
    2.4.6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定  28-30
      2.4.6.1 Bradford 标准曲线的绘制  28-29
      2.4.6.2 蛋白样品的制备及其含量测定  29-30
    2.4.7 盐胁迫下酵母胞内蛋白分子量的测定  30-31
      2.4.7.1 SDS-PAGE 电泳技术  30
      2.4.7.2 蛋白质分子量计算方法  30-31
  2.5 结果与讨论  31-38
    2.5.1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定  31-32
    2.5.2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长情况观察  32
    2.5.3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定  32-33
    2.5.4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定  33-34
    2.5.5 盐胁迫下发酵 pH 值的测定  34-35
    2.5.6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定  35-36
    2.5.7 盐胁迫下酵母胞内蛋白的 SDS-PAGE 图谱  36-38
  2.6 小结  38-39
第三章盐胁迫下酿酒酵母的渗透调节机制  39-52
  3.1 实验材料  39
    3.1.1 菌株  39
    3.1.2 培养基  39
  3.2 实验仪器  39-40
  3.3 实验药品  40
  3.4 实验方法  40-45
    3.4.1 酿酒酵母培养  40
    3.4.2 盐胁迫下酵母胞内 Na~+、K~+离子浓度测定  40-42
      3.4.2.1 测定条件  40-41
      3.4.2.2 Na~+、K~+标准曲线的绘制  41-42
      3.4.2.3 胞内 Na~+、K~+离子提取测定  42
    3.4.3 盐胁迫下酵母胞内海藻糖含量测定  42-43
      3.4.3.1 海藻糖标准曲线的绘制  42-43
      3.4.3.2 胞内海藻糖的提取和测定  43
    3.4.4 盐胁迫下酵母胞内、胞外甘油含量的测定  43-45
      3.4.4.1 甘油标准曲线的绘制  43-44
      3.4.4.2 酵母菌中甘油的提取测定  44-45
  3.5 结果与讨论  45-51
    3.5.1 盐胁迫下酵母胞内 Na~+、K~+离子浓度动态变化规律  45-48
      3.5.1.1 胞内 Na~+的动态变化规律  45-46
      3.5.1.2 胞内 K~+的动态变化规律  46-47
      3.5.1.3 胞内 Na~+/K~+比的动态变化规律  47-48
    3.5.2 盐胁迫下酵母胞内海藻糖的动态变化规律  48-49
    3.5.3 盐胁迫下酵母菌中甘油的动态变化规律  49-51
      3.5.3.1 胞内甘油的动态变化规律  49-50
      3.5.3.2 胞外甘油的动态变化规律  50-51
  3.6 小结  51-52
第四章盐胁迫下酿酒酵母分泌蛋白的提取分离  52-63
  4.1 实验材料  52-53
    4.1.1 菌株  52
    4.1.2 培养基  52-53
  4.2 实验仪器  53
  4.3 实验药品  53
  4.4 实验方法  53-55
    4.4.1 酿酒酵母培养  53-54
    4.4.2 酵母菌株在盐胁迫下的生长量测定  54
    4.4.3 酵母分泌蛋白的制备  54
    4.4.4 样品的凝胶层析分离  54-55
      4.4.4.1 凝胶溶胀  54
      4.4.4.2 装柱和平衡  54
      4.4.4.3 色谱床校正  54-55
      4.4.4.4 加样  55
      4.4.4.5 洗脱与收集  55
  4.5 结果与讨论  55-61
    4.5.1 不同浓度 NaCl 胁迫下酿酒酵母的生长曲线  55-56
    4.5.2 凝胶过滤层析技术分离酵母分泌蛋白  56-61
      4.5.2.1 Sephadex G-25 分离 YNB 对照组的分泌蛋白图谱  56-57
      4.5.2.2 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 0.3 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱  57-58
      4.5.2.3 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 0.6 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱  58-60
      4.5.2.4 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 1.0 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱  60-61
  4.6 小结  61-63
第五章结论与展望  63-65
  5.1 结论  63-64
  5.2 展望  64-65
参考文献  65-69
致谢  69-70
附录 A  70-71
附录 B  71

盐胁迫下酿酒酵母生理生化特性的研究

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