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产土味素菌群对白酒酿造的影响机制及监测控制

作　者: 杜海
导　师: 徐岩
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 土味素链霉菌土味素合成酶七烯大环内酯类抗生素白酒
分类号: TS262.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

我们前期的研究已发现，萜类化合物土味素（geosmin）产生的土霉异味是影响中国清香型白酒风味品质的主要原因。异味物质的存在，很大程度上表征着发酵不正常。其中包括正常酿造微生态的平衡的破坏，酿造功能的下降。最终体现为酒体品质的下降，酿造原料的浪费。因而，本研究中针对导致白酒中土霉异味的异味物质的产生机制，以及在异常发酵状态下对酿造微生态及功能的影响机制进行深入、系统的研究，不仅对于提高白酒的品质和食品安全具有重要应用价值，而且对于认识中国传统酿造食品的发酵机制和丰富微生物学理论也具有重要意义。本研究运用风味导向学术思想，首次明确了白酒中的土霉味物质的来源为微生物代谢合成。并采用现代分子生物学手段建立基于土味素关键合成酶编码基因实时荧光定量PCR方法对产土味素的链霉菌进行快速检测和跟踪。发现并证实产土味素链霉菌的重要代谢物对固态发酵微生物群落结构的调节规律和机制，建立了揭示中国白酒复杂体系中异味物质微生物产生机理的研究方法。主要创新性结论如下：1.运用风味导向技术，从复杂的白酒酿造菌群结构中成功筛选得到五株产生明显土霉气味的土味素代谢菌株。根据其菌落、细胞形态和生理生化特征，以及放线菌/链霉菌特异分类鉴定引物鉴定，确定这五株菌株均为链霉菌（Streptomyces）。选择基于放线菌16S核糖RNA特异引物——Com2xf/Ac1186r，采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分析白酒生产过程中可能产生土味素的放线菌的群落结构。发现白酒大曲中的放线菌结构较为简单。清茬大曲中放线菌菌群最为丰富，并随着大曲培养时间的延长菌群的的多态性更为明显。土味素产生菌的菌群结构会受到工艺，地理环境和气候等因素的影响。2.系统研究白酒异常酿造微生态中各菌种间生长规律，发现产土味素链霉菌与白酒酿造中的功能微生物有明显的竞争关系。同一酿造环境中，链霉菌的生长代谢对酿造功能微生物有不同程度的抑制作用。其中，菌株QC-2对贡献主要白酒风味的真菌类微生物，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和异常汉逊酵母（Hansenula anomala），具有明显抑制作用。同时，影响由功能酵母代谢生成的醇类、酯类等白酒重要风味物质的形成。进一步研究发现酵母，霉菌等功能微生物的繁殖周期较短，白酒酿造系统中大量的功能微生物生长对产土味素链霉菌也有一定的抑制作用，揭示了群体微生物固态发酵体中土味素产生菌与功能微生物之间的相互影响的机制。3.围绕产土味素链霉菌抑制群体微生物的分子机制，通过超高效液相色谱（UPLC）-二极管阵列检测器（PDA）检测，证实白酒酿造中具有明显抑制酿造真菌特性的链霉菌代谢产物中存在9个可能具有抗真菌活性的组分，且均在360nm、380nm、400nm三波段有明显吸收的特征紫外吸收谱。经过进一步超高压液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）检测，分子模拟，添加标准品等方式，确定抗真菌活性物质为一系列七烯大环内酯类同系物的抗生素。从而明确了产土霉异味链霉菌对白酒酿造群落结构的影响机制。4.针对群体微生物固态酿造的复杂性和菌体鉴别定量的难题，采用分子生物学手段钓取土味素合成酶的编码基因（geoA），证实所筛选到的链霉菌中存在与合成土霉味萜烯类化合物等萜类物质相关的土味素合成酶。通过考察不同微生物中的土味素合成酶编码基因的同源性，建立了基于土味素合成酶编码基因保守序列的实时荧光定量PCR方法。该方法对白酒酿造过程中常见不产土味素微生物无非特异性扩增。与应用放线菌特异引物荧光定量PCR结果相比较，发现白酒大曲中约1~10%的放线菌含有geoA基因。通过对合成土味素编码基因的核酸量进行定量分析，可实现在白酒酿造复杂基质中与土霉异味直接相关的灵敏、快速的生物定量分析，为可疑风味污染源预测、传播环境调查、产生菌溯源等工作奠定基础。5.针对白酒群体微生物固态酿造体系的特征，系统研究了酿造环境因素（温度、水分、pH、乙醇含量等）对产土味素链霉菌生长代谢的影响规律。研究发现：产土味素链霉菌最适生长温度为30℃，最适生长的基质含水量为50%。菌体在中性偏碱性（pH=7~8）的环境中可以大量繁殖。并会产生弱碱性的吡嗪类物质调节周围生长环境。在酸性（pH=3~5）环境中，酒精度高于10%vol的酿造环境中，菌体生长受到完全抑制。上述研究发现为白酒酿造过程中通过控制关键环境因素达到控制或抑制该化合物的合成提供可靠的理论依据，从而实现从根源上降低或消除白酒中土霉气味的目的。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-20
  1.1 食品和饮料中异味概述  9
  1.2 中国白酒酿造及其微生物代谢风味物质的特征  9-11
  1.3 国内外食品饮料中常见异味研究进展  11-18
    1.3.1 国内外食品饮料中常见异味研究  11-13
    1.3.2 中国白酒常见异味及其研究现状  13-14
    1.3.3 白酒中土霉异味的研究现状  14-16
    1.3.4 主要呈土霉异味物质的生物合成途径  16-18
  1.4 本课题研究内容及意义  18-20
    1.4.1 白酒发酵过程中土霉异味研究存在的问题  18
    1.4.2 本论文的研究内容及意义  18-20
第二章白酒大曲中产土味素微生物发现及其群落结构的研究  20-32
  2.1 前言  20
  2.2 材料和方法  20-23
  2.3 结果和讨论  23-31
    2.3.1 白酒酿造环境中产土味素微生物筛选策略及结果  23-24
    2.3.2 筛选结果及菌株形态和分子生物学鉴定  24-28
    2.3.3 产土味素链霉菌发酵产物中挥发性组分分析  28-30
    2.3.4 基于16S rRNA基因特异引物分析大曲中放线菌的群落结构  30-31
  2.4 本章小结  31-32
第三章产土味素链霉菌影响酿造微生物生长及风味代谢规律  32-44
  3.1 前言  32-33
  3.2 材料和方法  33-35
  3.3 结果和讨论  35-42
    3.3.1 产土味素链霉菌对酿造过程主要功能微生物的影响  35-37
    3.3.2 主要酿造微生物对产土味素菌株生长的影响  37-38
    3.3.3 麸曲培养中链霉菌对关键酿造微生物生长及风味代谢的影响  38-40
    3.3.4 模拟白酒发酵体系中链霉菌对关键酿造微生物生长及风味代谢的影响  40-42
  3.4 本章小结  42-44
第四章产土味素链霉菌抑制主要酿造微生物的机理  44-59
  4.1 前言  44
  4.2 材料和方法  44-46
  4.3 结果和讨论  46-58
    4.3.1 产土霉素菌株抑菌特性验证  46
    4.3.2 发酵过程中抑菌生物活性及土味素代谢特征  46-47
    4.3.3 抑菌活性物质检测方法的确定  47-50
    4.3.4 抑制真菌活性物质化学结构鉴定  50-58
  4.4 本章小结  58-59
第五章基于特征功能基因的产土味素菌群检测方法的建立  59-78
  5.1 前言  59-60
  5.2 材料和方法  60-62
  5.3 结果和讨论  62-77
    5.3.1 产土味素菌株中土味素关键合成酶编码基因的克隆及序列分析  62-66
    5.3.2 基于土味素关键合成酶的荧光定量PCR方法的建立  66-75
    5.3.3 基于土味素关键合成酶和16S rRNA荧光定量结果分析  75-77
  5.4 本章小结  77-78
第六章白酒酿造环境对产土味素链霉菌的生长代谢影响研究  78-92
  6.1 前言  78-79
  6.2 材料和方法  79-80
  6.3 结果和讨论  80-90
    6.3.1 产土味素链霉菌生长及土味素代谢规律  80-82
    6.3.2 温度对产土味素链霉菌生长及土味素代谢的影响  82-84
    6.3.3 水分对产土味素链霉菌生长的影响  84-85
    6.3.4 乙醇含量对产土味素链霉菌生长的影响  85
    6.3.5 pH对产土味素链霉菌生长及土味素代谢的影响  85-89
    6.3.6 白酒酿造实践中影响土味素产生环境因素的考察  89-90
  6.4 本章小结  90-92
主要结论与展望  92-94
论文创新点  94-95
参考文献  95-102
致谢  102-103
附录：博士在读期间已取得成果  103-105
附图  105-106

产土味素菌群对白酒酿造的影响机制及监测控制

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