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蛋白激发子PeaT1激发拟南芥早期信号反应及差异蛋白的研究

作　者: 李广悦
导　师: 邱德文
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛋白激发子 PeaT1 信号反应稳定同位素标记差异蛋白
分类号: S432.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

PeaT1是本试验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化获得的一种蛋白激发子,其分子量约为36kD;前期工作克隆了该蛋白的基因peaT1并在大肠杆菌中进行了表达。研究表明,该蛋白具有促进小麦生长和诱导烟草抗TMV的功能。本研究在此基础上,以拟南芥为材料,对PeaT1提高拟南芥的抗旱性、耐盐性和对灰霉病的抗性作用、诱导拟南芥的信号反应以及诱导拟南芥的差异表达蛋白进行了研究,主要研究结果如下:1、PeaT1蛋白的表达与纯化。对PeaT1进行了原核表达,SDS-PAGE检测表明,表达蛋白的表观分子量约为36 kD。通过Western-Blotting检测分析显示,蛋白表达正确。采用了亲和层析,阴离子交换层析,分子筛层析的经典三步纯化法对表达蛋白进行了纯化,最终获得了纯度大于90%的蛋白,为后面实验提供了材料。2、PeaT1的生物学功能。通过实验设计对高纯度的PeaT1蛋白进行了生物学功能检测。结果表明,PeaT1具有增强拟南芥抗旱性、耐盐性和提高拟南芥对灰霉病的抗性作用。证明PeaT1是一种多功能的蛋白激发子。3、PeaT1激发拟南芥产生早期信号反应的研究。以拟南芥为材料对PeaT1诱导其产生的前期反应进行了测定,发现PeaT1能诱导拟南芥的活性氧爆发、PH变化、钙离子浓度提高、一氧化氮产生以及酚类化合物合成,为PeaT1作用机制的研究奠定了基础。4、PeaT1诱导拟南芥差异蛋白的研究。应用稳定同位素标记的方法对拟南芥植株进行了完全标记,然后进行了差异蛋白的质谱鉴定。质谱鉴定结果经过数据库比对并与MSQuant软件定量计算后对差异显著的蛋白进行了功能分析,发现这些蛋白与压力、病程、代谢、转运功能相关,分析表明PeaT1通过诱导这些蛋白的差异表达从而提高拟南芥的抗病抗逆能力。5、PeaT1诱导拟南芥差异表达蛋白的RT-PCR及缺失突变体验证。对重要差异蛋白谷胱甘肽转硫酶6和过氧化物酶52的编码基因进行了RT-PCR验证和缺失突变体验证。结果表明,经PeaT1处理的拟南芥的两个蛋白的编码基因转录上调,24小时转录水平达到最高;两种蛋白缺失突变体对灰霉病抗性都明显下降,说明PeaT1通过诱导这两种蛋白的上调表达而提高了拟南芥抗性。本研究利用蛋白质组学最新技术探讨了PeaT1激发拟南芥防卫反应的分子机制,为进一步阐明PeaT1的作用机理奠定了基础。同时获得的大量差异表达蛋白为抗病相关的关键基因的鉴定提供了重要信息。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章绪论  14-22
  1.1 引言  14
  1.2 激发子的种类和性质  14
  1.3 激发子与信号传导  14-17
    1.3.1 钙信号的研究现状  16
    1.3.2 活性氧的产生及功能  16
    1.3.3 活性氧与钙信号之间的关系  16
    1.3.4 NO 在植物体内的信号分子作用  16-17
    1.3.5 酚类化合物的合成  17
    1.3.6 防卫基因的表达调控及其产物参与的抗病反应  17
  1.4 差异蛋白常用研究方法  17-20
    1.4.1 双向凝胶电泳技术  18
    1.4.2 稳定同位素标记结合质谱技术  18-20
  1.5 研究目的和意义  20-21
  1.6 技术路线  21-22
第二章 PeaT1 的表达纯化及生物活性  22-32
  2.1 材料与方法  22-26
    2.1.1 菌株及植物材料  22
    2.1.2 主要仪器与耗材  22
    2.1.3 PeaT1 的诱导表达  22
    2.1.4 目的蛋白的SDS-PAGE 检测  22-23
    2.1.5 Western-Blotting 检测目标蛋白  23-24
    2.1.6 使用His 柱进行初步纯化  24
    2.1.7 阴离子交换层析  24
    2.1.8 分子筛层析  24
    2.1.9 电泳检测纯化效果  24
    2.1.10 目的蛋白浓度的测定  24-25
    2.1.11 PeaT1 提高拟南芥对干旱的抗性  25
    2.1.12 PeaT1 提高拟南芥的耐盐性  25-26
    2.1.13 PeaT1 诱导拟南芥对灰霉病抗性的检测  26
  2.2 结果与分析  26-31
    2.2.1 PeaT1 的诱导表达及Western-Blotting 检测  26
    2.2.2 PeaT1 的纯化  26-28
    2.2.3 PeaT1 的浓度测定  28
    2.2.4 PeaT1 提高拟南芥抗旱性  28-29
    2.2.5 PeaT1 提高拟南芥耐盐性  29-30
    2.2.6 PeaT1 对拟南芥抗灰霉菌的影响  30-31
  2.3 小结与讨论  31-32
第三章 PeaT1 诱发拟南芥早期信号反应  32-40
  3.1 材料和方法  32-34
    3.1.1 植物材料  32
    3.1.2 主要仪器与耗材  32
    3.1.3 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生活性氧的定性检测  32
    3.1.4 PeaT1 诱导拟南芥叶片产生活性氧的定性检测  32
    3.1.5 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生活性氧的定量检测  32-33
    3.1.6 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞pH 变化的检测  33
    3.1.7 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生钙离子的检测  33
    3.1.8 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生一氧化氮的检测  33
    3.1.9 PeaT1 诱导拟南芥叶片产生酚类化合物的检测  33-34
  3.2 结果与分析  34-39
    3.2.1 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生活性氧  34
    3.2.2 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生活性氧的定量检测  34-35
    3.2.3 PeaT1 诱导拟南芥叶片产生活性氧的检测  35-36
    3.2.4 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞pH 变化  36
    3.2.5 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生钙离子  36-37
    3.2.6 PeaT1 诱导拟南芥悬浮细胞产生一氧化氮的检测  37-38
    3.2.7 PeaT1 诱导拟南芥叶片产生酚类化合物  38-39
  3.3 小结与讨论  39-40
第四章 PeaT1 诱导拟南芥差异表达蛋白的研究  40-47
  4.1 材料与方法  40-42
    4.1.1 培养基及植物材料  40
    4.1.2 仪器及耗材  40
    4.1.3 拟南芥的同位素标记  40
    4.1.4 拟南芥总蛋白的提取  40-41
    4.1.5 拟南芥同位素标记效率的计算方法  41
    4.1.6 PeaT1 诱导差异蛋白的质谱鉴定及蛋白定量  41-42
  4.2 结果与分析  42-45
    4.2.1 拟南芥总蛋白的提取  42
    4.2.2 拟南芥的同位素标记效率  42-43
    4.2.3 PeaT1 诱导差异表达蛋白的鉴定及定量  43-45
  4.3 小结与讨论  45-47
第五章 PeaT1 诱导拟南芥差异表达蛋白的RT-PCR 与缺失突变体证  47-53
  5.1 材料与方法  47-50
    5.1.1 植物材料  47
    5.1.2 仪器及耗材  47
    5.1.3 内参的选取及引物的设计  47-48
    5.1.4 总RNA 的提取  48
    5.1.5 RT-PCR  48-49
    5.1.6 拟南芥突变体灰霉病抗性的变化  49-50
  5.2 结果与分析  50-52
    5.2.1 总RNA 的提取  50
    5.2.2 RT-PCR  50-51
    5.2.3 拟南芥突变体抗病性检测  51-52
  5.3 小结与讨论  52-53
全文结论  53-55
参考文献  55-61
附录  61-62
致谢  62-63
作者简历  63

蛋白激发子PeaT1激发拟南芥早期信号反应及差异蛋白的研究

内容摘要

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