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盐离子对A.ventrcosus MiSp组合模块的影响

作　者: 王佳
导　师: 孟清
学　校: 东华大学
专　业: 生物化工
关键词: 次壶腹腺丝组装盐离子二级结构丝纤维
分类号: TS102.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

蛛丝作为一种天然高分子量的蛋白质纤维,具有良好的生物学品质和机械学性能,如强度高、弹性好及生物相容性好等,是一种很有潜力的生物材料。由于蜘蛛自相残食的天性而无法大规模养殖,因此通过基因工程技术来获取蛛丝蛋白成为一种有效的方法。但是,重组蛛丝蛋白在异源宿主内的表达量低且蛛丝蛋白由溶液转变为丝纤维的成丝机制尚不明确等,从而限制了蛛丝纤维的后续应用。因此,掌握蛛丝蛋白在体外的成丝机制是工业化生产高品质纤维的必要条件。由大腹园蛛次壶腹腺丝蛋白全长编码基因翻译的蛋白质glycine和alanine含量达到64%,且其重复模块主要以glycine-X、 glycine-X-X、glycine-X-X-X和poly-alanine等形式存在。MiSp全长氨基酸序列除可划分为NT、CT以及Rep外,还包含2个氨基酸序列完全相同的间隔区spacer,它们在蛛丝蛋白自组装以及丝性能等方面分别行使不同的生物学功能。基于大腹园蛛次壶腹腺丝全长基因构建4个克隆,研究不同生理环境对蛛丝蛋白自组装成纤维的影响,进而为仿生蛛丝纤维奠定理论基础。本课题开展了如下研究工作：1)四个克隆NTR1SR2CT、R1SR2CT、R1R2CT、R1R2的构建。2)四个重组蛛丝蛋白的表达及纯化。3)四个重组蛋白自组装成纤维的对比。4)测定重组蛛丝蛋白NTR1SR2CT的二级结构。5)测定不同盐离子(浓度)情况下重组蛛丝蛋白NTR1SR2CT的自组装成纤维情况。针对以上几个方面的研究,都取得了良好的结果：1)以A.ventrcosus MiSp全长基因为模板,运用PCR扩增及I型限制性内切酶Bsa I介导的无缝连接技术成功的构建了四个克隆NR1SR2CT、R1SR2CT、R1R2CT、R1R2,并得以测序验证。2)四个蛋白中,R1R2CT蛋白、R1R2蛋白是可溶的,采用NI-NTA非变性纯化；NTR1SR2CT蛋白形成包涵体,采用洗包涵体变性纯化方式；R1SR2CT蛋白部分可溶,部分形成。对于NTR1SR2CT与R1SR2CT,不用顾忌提高温度会使蛋白形成包涵体,可通过提高诱导温度提高表达量。NR1SR2CT蛋白形成包涵体,是由于大肠杆菌在培养的过程中代谢产酸,使pH降低,诱导NT形成二聚体,从而促使其自组装。而R1SR2CT形成部分包涵体,可能是由于S亦能感应pH变化,促进蛛丝蛋白空间结构的转变,从而诱导其自组装成纤维。3)将纯化后的四种蛋白分别透析到Tris-cl pH7.0,涂到铝箔纸上,过夜自然干燥。通过SEM观察四个蛋白的自组装后形态,NTR1SR2CT薄膜表面呈有序纤维状,R1SR2CT与R1R2CT薄膜无多大差异,表面呈小球聚集状,R1R2薄膜表面无明显特征形貌。NT与CT在成纤维的过程起非常重要的调节作用。4)重组蛛丝蛋白NTR1SR2CT溶液二级结构主要为random coil或helix,在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β-sheet,甲醇能促进该转变过程。5)钾离子和磷酸根离子促进NTR1SR2CT重组蛋白自组装从而促进丝纤维的形成,而低浓度的NaCl有利于促进蛛丝蛋白的溶解性。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-14
第一章绪论  14-32
  1.1 前言  14
  1.2 蛛丝的种类  14-16
  1.3 蛛丝的分子组成  16-26
    1.3.1 主壶腹腺丝蛋白  16-19
    1.3.2 次壶腹腺丝蛋白  19-21
    1.3.3 鞭毛状腺丝蛋白  21-23
    1.3.4 包卵丝蛋白  23-24
    1.3.5 葡萄状腺丝蛋白  24-25
    1.3.6 梨形腺丝蛋白  25
    1.3.7 聚合状腺体粘液蛋白  25-26
  1.4 蛛丝蛋白的自组装  26-28
    1.4.1 天然蛛丝蛋白的自组装  26-27
    1.4.2 重组蛛丝蛋白的自组装  27-28
  1.5 蛛丝的应用  28
  1.6 重组蜘蛛丝蛋白的分子设计及表达  28-30
  1.7 重组蛛丝蛋白的人工纺丝  30-31
  1.8 本课题研究的内容和意义  31-32
第二章实验材料、基本技术和设计方案  32-49
  2.1 材料和仪器  32-40
    2.1.1 菌株和质粒  32
    2.1.2 酶与主要试剂  32-34
    2.1.3 主要仪器设备  34-35
    2.1.4 培养基和常用试剂的配置  35-40
  2.2 实验基本技术  40-48
    2.2.1 引物磷酸化  40
    2.2.2 PCR反应  40-41
    2.2.3 限制性内切酶酶切  41-42
    2.2.4 凝胶回收  42
    2.2.5 质粒抽提  42-43
    2.2.6 化学转化  43
    2.2.7 蛋白诱导表达  43-44
    2.2.8 蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)  44
    2.2.9 Western blot印迹  44-45
    2.2.10 蛋白纯化  45-46
    2.2.11 自组装颗粒大小的测定  46-47
    2.2.12 Zeta电位测定  47
    2.2.13 样品表面观察  47-48
  2.3 实验方案  48-49
第三章实验过程  49-62
  3.1 以PT7HisTrxHis为载体克隆的构建  49-57
    3.1.1 R1SR2克隆的构建  49-51
    3.1.2 R1R2克隆的构建  51-53
    3.1.3 R1SR2C克隆的构建  53-55
    3.1.4 NTR1SR2CT克隆的构建  55-57
  3.2 重组蛛丝蛋白表达及Western Blot检测  57-58
    3.2.1 重组蛛丝蛋白表达  57
    3.2.2 重组蛛丝蛋白可溶性分析  57
    3.2.3 Western blot验证表达的重组蛛丝蛋白  57-58
    3.2.4 优化诱导表达温度  58
    3.2.5 大规模蛋白纯化  58
  3.3 重组蛛丝蛋白溶液透析和冷冻干燥  58-59
    3.3.1 透析  58-59
    3.3.2 冷冻干燥  59
  3.4 重组蛛丝蛋白成纤维表面形态观察  59
  3.5 重组蛛丝蛋白的二级结构  59-60
  3.6 盐离子对重组蛛丝蛋白自组装的影响  60-61
    3.6.1 重组蛛丝蛋白制样  60
    3.6.2 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer测定重组蛛丝蛋白上清浓度  60
    3.6.3 重组蛛丝蛋白自组装颗粒的大小  60-61
    3.6.4 Zeta电位  61
    3.6.5 重组蛛丝蛋白自组装形态观察  61
  3.7 溶剂挥发速率对成纤维的影响  61-62
第四章实验结果  62-74
  4.1 以PT7HisTrxHis为载体一系列克隆的鉴定  62
  4.2 重组蛛丝蛋白的表达及Western blot特异性鉴定  62-64
  4.3 重组蛛丝蛋白的纯化  64-66
  4.4 重组蛛丝蛋白成纤维表面形态  66-67
  4.5 重组蛛丝蛋白二级结构  67-68
  4.6 盐离子对重组蛛丝蛋白自组装的影响  68-72
    4.6.1 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer测定蛋白上清浓度  68-69
    4.6.2 自组装颗粒的大小  69-70
    4.6.3 Zeta电位  70-71
    4.6.4 自组装蛋白形貌观察  71-72
  4.7 溶剂挥发速率对成纤维的影响  72-74
第五章分析讨论  74-78
  5.1 不同模块蛛丝蛋白的表达及成膜情况  74-75
  5.2 蛛丝蛋白的二级结构  75
  5.3 盐离子及溶剂挥发速率对蛛丝蛋白自组装的影响  75-76
  5.4 创新点  76
    5.4.1 首次对重组次壶腹腺丝蛋白的自组装进行研究  76
    5.4.2 基因无缝连接  76
  5.5 展望  76-78
参考文献  78-84
附录  84-85
硕士期间发表论文和参加科研情况说明  85-86
致谢  86

盐离子对A.ventrcosus MiSp组合模块的影响

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