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系统生物学水平解析维生素C生产菌株生理特性与相互作用关系

作　者: 邹伟
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 生酮基古龙酸菌 巨大芽孢杆菌 基因组规模代谢网络模型 流量平衡分析 系统生物学
分类号: TQ920.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本论文以维生素C工业生产菌株生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgareWSH001)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium WSH002)组成的人工微生物生态系统为研究对象，结合目前关于两菌生理生化水平和组学水平(基因组学、蛋白组学、代谢组学)研究结果，通过构建基因组规模代谢网络模型(Genome scale metabolic model, GSMM)和基于约束的算法(constraints-based methods)，从系统生物学水平解析K. vulgare的生理特性及其与B. megaterium之间的相互作用机制，主要研究结果如下：1.基于RAST、KAAS、PRIAM、本地BLASTp注释K. vulgare基因组，共有834个蛋白注释出EC号且具有较高可信度。根据KAAS和本地BLASTp搜索TCDB数据库注释K. vulgare基因组共预测476个转运蛋白。基于本地BLASTp和比较基因组学显示K. vulgare RAST新注释的231个蛋白中186个具有功能注释或在K. vulgareY25中存在对应同源蛋白；B. megaterium RAST新注释的219个蛋白中153个具有功能注释或在B. megaterium QM B1551或DSM319中存在对应同源蛋白；2.通过代谢网络自动构建服务器Model SEED与KAAS，结合文献调研K. vulgare相关的生化信息、公共数据库、已报道实验结果等构建了K. vulgare的GSMM，命名为iWZ663，该模型包含663个基因、649个代谢物和830个反应。模型iWZ663中基因覆盖率达21.4%，反应可分为14个代谢亚系统，其中转运系统、碳水化合物代谢、氨基酸代谢所占比例最大，分别为16.5%、15.3%、15.2%；代谢物中与能量相关(ATP、ADP、NADP、NADPH、NAD、NADH)和氮代谢相关(谷氨酸、胺离子、甘氨酸)的代谢物在网络中占较大的连通度。模型注释K. vulgare山梨糖代谢途径发现山梨糖不仅可以转化成2-KLG或维生素C，也可进入中心碳代谢，为细胞生长提供能量和骨架；3.运用基于约束的算法结合Cobra工具箱在MATLAB平台上对K. vulgare GSMMiWZ663系统分析，发现模型iWZ663中116个基因被预测为生长必需基因，且均位于染色体上；153个反应被预测为生长必需反应。K. vulgare单独生长微弱的原因在于：(1)天冬酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、生物素、烟酸、焦磷酸硫胺素、二氢叶酸的合成途径不完整；(2) K. vulgare代谢山梨糖主要通过ED (Entner-Doudoroff)途径和戊糖磷酸途径而不是酵解途径，其中戊糖磷酸途径流量仅占碳流的5.7%，低水平的戊糖磷酸途径影响细胞还原力(NADPH)和碳骨架(戊糖等)的供给；(3) K. vulgare不能还原硫酸盐生成亚硫酸盐，阻碍了半胱氨酸和甲硫氨酸的合成并进一步影响胞内辅酶A和谷胱甘肽的合成。K. vulgare具有强大的多肽转运和水解能力，K. vulgare能代谢天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸参与TCA循环或核苷酸代谢；4.整合RAST新注释基因、代谢组学数据、碳氮源生长数据、亚细胞定位信息，将前期实验室构建的B. megaterium代谢网络模型iMZ992精炼升级为iMZ1055，该模型包含1055个基因、1137个代谢反应、1011个代谢物。统一K. vulgare与B. megateriumGSMM格式得到修饰后的两菌模型iWZ663a和iMZ1055a，二者共有453个反应和548代谢物相同。比较两菌GSMMs发现iMZ1055a的代谢能力更为多样，表现在：(1)具有15个特有的代谢亚系统而iWZ663a只有一个；(2)相比于iWZ663a，在组氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、核黄素代谢中也具备特殊的代谢功能；(3)必需反应分析显示iWZ663a中必需反应所占模型总反应比例是iMZ1055a的2倍多，iMZ1055a有51个非必需共有反应在iWZ663a是必需的，主要分布在嘌呤代谢、嘧啶代谢、核黄素代谢、泛酸与辅酶A生物合成等；(4) iMZ1055a可以合成并转运到胞外的代谢物有78种，而iWZ663a仅能合成和分泌22种代谢物。另外两者GSMMs在果糖与甘露糖代谢、泛醌与其他类萜醌生物合成、硫代谢和苯甲酸降解、转运系统中存在不同的代谢机制；5.整合模型iWZ663a和iMZ1055a构建维生素C二步发酵两菌代谢互作模型，命名为iWZ-KV-663-BM-1055，包含1718个基因、1583个代谢物和1910个反应。FBA与鲁棒性分析显示两菌间既存在共生也存在竞争的生理关系。FVA与必需反应分析显示B. megaterium伴生下：42个K. vulgare单菌模型时无流量通过的代谢反应有流量通过；36个在K. vulgare单菌模型时的必需反应转变为非必需反应；38个B.megaterium单菌模型中的非必需反应，主要参与合成K. vulgare的必需营养物质如焦磷酸硫胺素、生物素、烟酸、泛酸、二氢叶酸等，可以影响K. vulgare在混菌系统中达到最大生长速率。基于iWZ-KV-663-BM-1055分析两菌相互作用机制为：(1)K. vulgare与B. megaterium之间的相互作用主要通过胞外代谢物和反应相联系；(2)B. megaterium分泌23种代谢物到K. vulgare，其中15种营养物质K. vulgare自身也能合成；(3) K. vulgare自身的多数氨基酸、维生素和辅酶的合成途径无流量通过，但不同核苷酸之间的回补反应、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸的合成却有流量通过；(4)两菌代谢相互作用受两菌转运系统注释水平的影响。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 绪论  11-22
  1.1 概述  11
  1.2 国内外研究水平及发展趋势  11-19
    1.2.1 维生素 C 两菌 AME 基本特性  11-14
    1.2.2 基于组学分析的两菌关系解析  14-16
    1.2.3 维生素 C 混菌系统的优化与调控  16-18
    1.2.4 维生素 C 生产菌株适应非生长适宜环境的机制解析  18-19
  1.3 本论文的主要研究内容  19-22
    1.3.1 基于全基因组规模代谢网络模型解析微生物生理特性  19-20
    1.3.2 本论文的主要研究内容  20-22
第二章 维生素 C 生产菌株基因组注释  22-31
  2.1 前言  22-23
  2.2 材料与方法  23-25
    2.2.1 基因组下载  23
    2.2.2 基于 RAST 的 K. vulgare 基因组自动注释  23
    2.2.3 基于 KAAS 的 K. vulgare 基因组自动注释  23
    2.2.4 基于 PRIAM 的 K. vulgare 基因组本地注释  23-24
    2.2.5 基于本地 BLAST 的 K. vulgare 基因组注释  24
    2.2.6 不同基因组注释方法的整合  24-25
    2.2.7 RAST 新注释基因功能注释  25
  2.3 结果与讨论  25-29
    2.3.1 K. vulgare 基因组 RAST 注释及其与原 NCBI 注释比较  25-26
    2.3.2 四种不同基因组注释方法的比较  26-28
    2.3.3 K. vulgare 基因组转运系统的注释结果  28
    2.3.4 K. vulgare 与 B. megaterium RAST 新基因的功能注释  28-29
  2.4 本章小结  29-31
第三章 K. vulgare 基因组规模代谢网络模型 iWZ663 的构建  31-48
  3.1 前言  31
  3.2 材料与方法  31-37
    3.2.1 代谢网络模型构建过程所使用的数据库和软件  31-32
    3.2.2 代谢粗网络的构建  32-33
    3.2.3 代谢粗网络的手动精炼  33-34
    3.2.4 K. vulgare 蛋白质亚细胞定位  34
    3.2.5 K. vulgare 生物量方程的构建  34-35
    3.2.6 代谢网络转化为数学模型  35
    3.2.7 代谢反应质量电荷平衡分析  35
    3.2.8 代谢网络漏洞的查找与填补  35
    3.2.9 代谢网络模型的调试与验证  35
    3.2.10 流量平衡分析  35-36
    3.2.11 代谢网络模型的命名  36
    3.2.12 代谢网络模型构建过程所用的 Cobra 工具箱程序  36-37
  3.3 结果与讨论  37-46
    3.3.1 K.vulgare 基因组规模代谢网络模型的构建过程  37-43
    3.3.2 K. vulgare 基因组规模代谢网络模型 iWZ663 的基本特征  43-46
    3.3.3 K. vulgare 山梨糖代谢途径注释  46
  3.4 本章小结  46-48
第四章 基于模型 iWZ663 解析 K. vulgare 生理特性  48-60
  4.1 前言  48
  4.2 材料与方法  48-50
    4.2.1 流量平衡分析  48
    4.2.2 鲁棒性分析  48-49
    4.2.3 K. vulgare 必需基因与必需反应预测  49
    4.2.4 模拟条件  49-50
    4.2.5 基于约束的算法分析 GSMM 所用的 Cobra 工具箱程序  50
  4.3 结果与讨论  50-58
    4.3.1 K. vulgare 生长限制因素与 2-KLG 生产模拟  50-52
    4.3.2 必需基因与必需反应  52-54
    4.3.3 K. vulgare 代谢山梨糖时中心碳代谢分析  54
    4.3.4 K. vulgare 氨基酸吸收与代谢分析  54-56
    4.3.5 K. vulgare 嘌呤核苷酸合成途径分析  56
    4.3.6 K. vulgare 硫代谢与辅酶 A 合成模块分析  56-58
  4.4 本章小结  58-60
第五章 基于 GSMMs 比较解析两菌代谢差异  60-74
  5.1 前言  60
  5.2 材料与方法  60-62
    5.2.1 两菌 GSMMs 的精炼与统一  60-61
    5.2.2 流量平衡分析  61
    5.2.3 精炼后两菌 GSMMs 必需反应预测  61
    5.2.4 模拟条件  61-62
  5.3 结果与讨论  62-73
    5.3.1 B. megaterium 代谢网络模型的精炼  62-69
    5.3.2 两菌 GSMMs 格式统一  69-70
    5.3.3 iWZ663a 与 iMZ1055a 代谢途径差异比较  70-71
    5.3.4 iWZ663a 与 iMZ1055a 必需反应差异比较  71-72
    5.3.5 iWZ663a 与 iMZ1055a 代谢物合成与分泌差异比较  72-73
  5.4 本章小结  73-74
第六章 基于两菌代谢互作网络模型解析两菌相互作用机理  74-84
  6.1 前言  74-75
  6.2 材料与方法  75-76
    6.2.1 两菌代谢互作网络模型的构建  75
    6.2.2 流量平衡分析  75
    6.2.3 鲁棒性分析  75
    6.2.4 流量可变分析  75
    6.2.5 必需反应分析  75-76
    6.2.6 两菌代谢互作网络模型可视化  76
    6.2.7 模拟条件  76
  6.3 结果与讨论  76-83
    6.3.1 两菌代谢互作网络模型的基本特性  76
    6.3.2 基于 iWZ-KV-663-BM-1055 解析两菌生理关系  76-77
    6.3.3 基于 iWZ-KV-663-BM-1055 解析 B. megaterium 伴生特性  77-80
    6.3.4 基于 iWZ-KV-663-BM-1055 解析两菌代谢相互作用  80-83
  6.4 本章小结  83-84
主要结论与展望  84-86
  主要结论  84-85
  展望  85-86
论文创新点  86-87
致谢  87-88
参考文献  88-99
附录 I: 作者在攻读博士学位期间发表的论文  99-100
附录 II: 缩略语表  100-102
附录 III: 两菌代谢互作网络模型胞外代谢物列表  102-108

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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