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血红蛋白及血红素结构的光谱和电化学研究

作　者: 赵莹雪
导　师: 洪军
学　校: 河南大学
专　业: 动物学
关键词: 血红蛋白人工过氧化物酶自组装直接电化学光谱学
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

以血红素为活性中心的氧化还原蛋白酶直接电化学的研究是目前生物电化学研究的热点，比如血红蛋白（Hb）、肌红蛋白（Mb）、辣根过氧化物酶（HRP）、过氧化氢酶（CAT）、细胞色素c（Cty c）等蛋白酶在电化学方面的研究报道有很多。通过研究血红素蛋白酶与电极间的电子传递过程，可以了解生物体内电子传递机理和生理作用机理，也为第三代蛋白酶生物传感器的研发提供了理论基础。人工模拟生物体内蛋白酶的方法技术对解决天然蛋白酶的局限性以及代替天然蛋白酶用于生物学和化学分析等都很重要的意义。本实验采用高分子纳米复合功能化材料将血红蛋白固定在玻碳电极上，通过循环伏安法研究了血红蛋白的直接电化学特性，采用线性扫描和时间电流测试了修饰电极对过氧化氢（H₂O₂）的催化响应。结果表明：血红蛋白受电极表面控制影响，血红蛋白被成功固定在电极表面并能进行有效地直接电子转移，血红蛋白与电极之间氧化还原反应为单电子传递过程，电子传递率ks为4.2±0.2s^-1；通过电流时间法测试出该电极能保持对H₂O₂还原的生物催化活性对H₂O₂有响应，其检测范围为0.05～1nM，最低检测限为0.05（±0.01nM）。测得血红蛋白的表观米氏常数Kmapp为0.85（±0.1） nM。实现了对H₂O₂高灵敏度低检测限的检测，为研制出第三代痕量H₂O₂生物传感器奠定了基础。本实验采用半合成酶制备的原理，用内部疏水的SDS结构模拟酶的外部结构，用小分子的血红素和组氨酸模拟酶的内部催化活性结构，通过自组装的方式以天然辣根过氧化物酶（HRP）为特征构建了人工过氧化物酶，模拟其催化活性并应用于生物电化学的研究。首先，本工作采用光谱学法对由50mM SDS纳米胶团和10μM血红素（heme）-50mM组氨酸（His）溶液自组装构建的人工过氧化物酶的催化能力、结构、酶动力学、自杀性失活进行了研究。结果表明：采用愈创木酚氧化法测定人工过氧化物酶、heme及天然HRP的表观催化活性，观察到了人工过氧化物酶具有良好的催化过氧化氢及愈创木酚发生氧化反应的活性，且人工过氧化物酶在pH8.0时表现出较高的表观活性；在临界胶团浓度（CMC）以上，SDS胶团的浓度对人工过氧化物酶的活性几乎没有影响，组氨酸浓度对人工过氧化物酶的活性有一定影响，在一定浓度范围内会随着His浓度增加而增加；测试得到其具有可观的催化效率，其中酶动力学参数Km值为5.5μM，催化速率常数为0.06s^-1，人工过氧化物酶催化效率为0.011μM^-1s^-1，相当于天然HRP催化效率的15%。本文还测试了人工过氧化物酶在高浓度H₂O₂下的稳定性，数据显示人工过氧化物酶会随着H₂O₂浓度的增加反应速度增加，在酸性环境中，人工过氧化物酶对高浓度H₂O₂抵抗能力强，但反应速度比较慢；而人工过氧化物酶在碱性环境中，抵抗底物自杀性失活能力比较弱，但酶反应速度最快，说明低pH溶液有助于结构稳定，高pH溶液有利于活性的提高。再者，采用电化学分析法对人工过氧化物酶的电化学特性进行了研究。本实验将人工过氧化物酶固定在高分子纳米复合材料修饰的玻碳电极上。通过循环伏安法进行研究，结果表明，人工过氧化物酶在电极表面能进行有效地直接电子转移且为固化机制；并且通过该电极对H₂O₂进行线性扫描法检测，结果表明固定在电极表面的人工过氧化物酶能够保持其生物催化活性，可以实现对底物过氧化氢的检测，电化学法测得人工过氧化物酶的表观米氏常数Kmapp为1.57mM，为生物电化学研究扩展了研究对象并为人工过氧化物酶的研究提供了一种新思路、新方法。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
1 引言  12-18
  1.1 氧化还原酶概述  12-13
  1.2 血红蛋白直接电化学概述  13
  1.3 人工过氧化酶概述  13-14
  1.4 生物蛋白酶研究方法  14-15
    1.4.1 光谱分析法  14-15
    1.4.2 电化学分析法  15
  1.5 电极修饰材料  15-16
    1.5.1 表面活性剂  15-16
    1.5.2 纳米材料  16
  1.6 蛋白质酶的固定化技术  16
  1.7 本论文目的  16-18
2 血红蛋白在纳米复合材料修饰电极上的直接电化学  18-34
  2.1 实验部分  19-21
    2.1.1 试剂和仪器  19
    2.1.2 材料制备  19-20
    2.1.3 血红蛋白在电极上的固定化  20
    2.1.4 电化学测试  20-21
  2.2 结果与讨论  21-32
    2.2.1 材料表征  21-23
    2.2.2 血红蛋白直接电化学  23-24
    2.2.3 不同 pH 对电极的影响  24-27
    2.2.4 血红蛋白电化学固化机制及电化学参数  27-29
    2.2.5 H_2O_2检测  29-32
    2.2.6 修饰电极稳定性  32
  2.3 小结  32-34
3 光谱学电化学法研究纳米自组装人工过氧化物酶  34-52
  3.1 实验部分  35-38
    3.1.1 试剂  35
    3.1.2 仪器  35-36
    3.1.3 试剂配制  36
    3.1.4 人工过氧化物酶构建  36
    3.1.5 人工过氧化物酶活性测试  36-37
    3.1.6 人工过氧化物酶结构测试  37
    3.1.7 人工酶在高浓度 H_2O_2下的稳定性  37
    3.1.8 人工酶在电极上的固定化  37
    3.1.9 电化学测试  37-38
  3.2 结果与讨论  38-51
    3.2.1 血红素浓度对人工酶活性的影响  38-39
    3.2.2 不同浓度 SDS 对人工酶活性的影响  39-40
    3.2.3 不同浓度 His 对人工酶活性影响  40-41
    3.2.4 不同 pH 值对人工酶活性的影响  41-42
    3.2.5 人工酶结构测试  42-43
    3.2.6 人工酶酶促反应过程  43-44
    3.2.7 人工酶酶促动力学参数  44-45
    3.2.8 人工酶自杀性失活  45-47
    3.2.9 人工酶直接电化学行为表征  47-48
    3.2.10 不同 pH 对修饰电极影响  48-49
    3.2.11 电化学固化机制及电化学参数  49-50
    3.2.12 H_2O_2检测  50-51
  3.3 小结  51-52
4 结论  52-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
攻读学位期间发表的学术论文  61-62

血红蛋白及血红素结构的光谱和电化学研究

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