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染色体整合位点及组蛋白甲基化对HIV潜伏的影响

作　者: 丁冬林
导　师: 朱焕章
学　校: 复旦大学
专　业: 生物工程
关键词: HIV潜伏整合位点 CpG岛甲基化组蛋白甲基化
分类号: Q343.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合症,是感染了人类免疫缺陷病毒(HIV-1)后发生的一种传染性疾病。在艾滋病的治疗方面,虽然应用高效抗逆转录病毒治疗法可以有效抑制HIV的复制,但是这种治疗方法依然不能完全清除HIV。这主要是因为由HIV潜伏细胞所组成的病毒储存库的长期存在。目前,尽管人们认为HIV病毒储存库的形成与HIV整合位点、表观遗传学有着密切的联系,但HIV潜伏的分子机制仍未完全阐明。为此,我们利用实验室前期建立的HIV潜伏细胞模型,一方面,利用反向PCR (Inverse PCR)技术对HIV前病毒在染色体上整合位点进行检测,通过在NCBI上比对,分析其整合特点,探讨其与HIV潜伏的相关性；另一方面,检测不同潜伏细胞HIV5’LTR上CpG岛甲基化程度,分析组蛋白甲基化在潜伏模型中的水平,探讨甲基化与HIV潜伏的关系。本研究获得了如下结果：首先,通过对4个HIV体外潜伏细胞模型HIV前病毒在染色体上整合位点检测,发现潜伏细胞模型中HIV的整合位点大部分都位于具有转录活性的基因区域内,提示HIV的整合对活性基因区域具有一定的偏向性。其次,为了探讨潜伏细胞系中HIV5’LTR CpG岛甲基化水平,我们通过亚硫酸氢盐处理细胞基因组模板后进行PCR扩增,测序比对后发现在这些潜伏模型内HIV5’LTR CpG为低甲基化,表明HIV潜伏的建立或许并不需要CpG岛甲基化的参与。最后,我们通过使用广谱的组蛋白甲基化酶抑制剂5-脱氧-5-甲基胞苷(5-deoxy-5-methylthioadenosine, MTA)处理潜伏细胞模型,发现C11细胞GFP阳性细胞率达到13.1%。MTA能够激活C11说明组蛋白甲基化可能在HIV的潜伏建立中扮演着重要的角色。为了进一步证明组蛋白甲基化的作用以及H3K9甲基化的修饰水平,我们使用了染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)的方法对H3K9二甲基化以及三甲基化的水平进行了探索。ChIP结果显示在经过MTA处理的C11细胞中,H3K9二甲基化水平比未经MTA处理组下调2.27倍,说明MTA是通过降低—H—3K9甲基化水平来促使潜伏细胞中HIV的重新激活,并且也说明HIV的潜伏与H3K9二甲基化水平的升高有着密切联系。我们还发现在潜伏细胞系模型C11中HIV5’LTR启动子区域H3K9二甲基化水平升高,说明在HIV潜伏建立过程中组蛋白甲基化可能扮演着重要鱼色。另外根据整合位点检测结果,4种HIV潜伏细胞系的整合位点位于不同的染色质上,可能使得各个潜伏细胞系中HIV启动子上表观跗修饰不相同,从而导致其余三个模型C1、C3以及C13细胞中潜伏的HIV未被MTA激活。本研究探讨并阐述了HIV潜伏的可能机制,为将潜伏的HIV重新激活提供了目标靶点,进而通过与药物联合治疗为HIV潜伏储存库的清除提供新思路。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
1 前言  8-10
2 材料与方法  10-24
  2.1 实验材料  10-12
  2.2 实验方法  12-24
3 结果  24-39
  3.1 反向PCR(Inverse PCR)扩增HIV的整合位点序列  24-25
  3.2 潜伏细胞系HIV整合位点侧翼序列的测定以及在人类基因组上的定位  25-33
  3.3 潜伏细胞系中HIV 5’LTR上CpG岛的甲基化分析  33-36
  3.4 5-脱氧-5-甲基胞苷(MTA)对潜伏细胞系的干预作用  36-37
  3.5 5-脱氧-5-甲基胞苷(MTA)对HW5’LTR启动子区域组蛋白甲基化的影响  37-39
讨论  39-41
参考文献  41-45
论文综述  45-64
  参考文献  53-64
已发表及待发表论文  64-65
致谢  65-66

染色体整合位点及组蛋白甲基化对HIV潜伏的影响

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