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融合蛋白TAT-XIAP的原核表达及其生物学活性的初步鉴定

作　者: 张晓红
导　师: 蒋常文
学　校: 桂林医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: X连锁调亡抑制蛋白融合蛋白原核表达生物学活性
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:体外合成X连锁调亡抑制蛋白(XIAP)基因编码区序列,将其插入空载体pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP原核表达载体,获得高产量、高纯度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白复性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物学活性。方法:体外合成大鼠XIAP基因编码区序列,将其插入pTAT-HA质粒,构建重组表达载体pTAT-XIAP,Nco I和Xho I酶对pTAT-XIAP质粒DNA进行双酶切并测序无误后,将pTAT-XIAP重组表达载体转入大肠埃希氏菌(E.coli)表达菌株BL21plysS。随机挑取阳性克隆的单菌落,接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜,当OD600=0.8-1时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM,诱导4h,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示目的蛋白主要以包涵体的形式存在。进一步优化表达条件,SDS-PAGE及蛋白印迹法(western blot)鉴定目的蛋白TAT-XIAP的表达形式。取TAT-XIAP包涵体蛋白溶解于8M尿素4℃过夜,离心取上清加入镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA),在变性的条件下,用20mM和50mM咪唑溶液各15mL进行洗脱,100mM咪唑溶液收集纯化的TAT-XIAP目的蛋白。SDS-PAGE鉴定该蛋白的纯化效果。将纯化后的TAT-XIAP蛋白、10%甘油和0.014mol/L的β-巯基乙醇装入透析袋,依次用6M、5M、4M、2M、1M尿素缓冲液和PBS 4℃磁力搅拌进行透析,获得了复性的TAT-XIAP融合蛋白。取CEN2对数生长期的细胞,不同浓度的融合蛋白TAT-XIAP作用不同时间,MTT法检测TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长的影响。SD大鼠腹腔注射复性后的TAT-XIAP融合蛋白,于注射12h后断头取大脑组织,冰冻切片,厚约6μm,免疫荧光显微镜下观察TAT-XIAP融合蛋白在脑组织的分布情况。结果:1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示pTAT-XIAP质粒DNA约4.5kb,pTAT-HA质粒DNA约3kb。pTAT-XIAP质粒DNA经NcoI/XhoI酶切鉴定,电泳结果显示在Marker约3kb处可见空载体pTAT-HA的条带,在Marker约1.5kb处可见XIAP的条带。2.12%SDS-PAGE结果显示TAT-XIAP目的蛋白分子量约64kD,该蛋白主要以包涵体的形式存在,经调整诱导温度、IPTG浓度及诱导时间等进一步优化诱导条件,发现TAT-XIAP目的蛋白仍主要以包涵体的形式存在。TAT-XIAP目的蛋白在变性条件下经镍离子亲和层析柱纯化,获得了高产量、高纯度的TAT-XIAP目的蛋白。TAT-XIAP融合蛋白经SDS-PAGE和western blot分析,在分子量约64kD处有一明显表达条带,实验结果与理论结果相符。3.蛋白复性后,MTT法检测TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长的影响,数据经统计学分析后,结果显示TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞的生长有促进作用。4.免疫荧光结果显示SD大鼠脑组织中有大量绿色荧光信号,其中以大脑皮质、基底节处多见。该蛋白主要分布在细胞浆中。PBS对照组除非特异性着色外,未见明显阳性绿色荧光信号。结论:1.成功构建pTAT-XIAP原核表达载体并表达出目的蛋白。2.重组蛋白TAT-XIAP经镍离子亲和层析纯化,获得了高产量、高纯度的目的蛋白。3.重组蛋白TAT-XIAP复性成功,动物实验证实该蛋白可成功穿透血脑屏障,MTT法检测发现TAT-XIAP融合蛋白对CEN2细胞生长有促进作用,其作用机制有待进一步研究。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
英汉缩略词对照表  10-11
前言  11-12
1 材料  12-16
  1.1 主要试剂  12-13
  1.2 主要试剂的配制  13-15
  1.3 实验仪器  15-16
2 方法  16-26
  2.1 大鼠 XIAP基因合成及表达载体的构建  16-19
  2.2 pTAT-XIAP 质粒扩增及鉴定  19
  2.3 目的蛋白TAT-XIAP 在BL21plysS 中的诱导表达及可溶性分析  19-22
  2.4 目的蛋白TAT-XIAP 的纯化  22-23
  2.5 目的蛋白TAT-XIAP 的western blot 鉴定  23-24
  2.6 融合蛋白TAT-XIAP 生物学活性的初步鉴定  24-26
3 结果  26-40
  3.1 表达载体pTAT-XIAP 的构建及酶切鉴定  26-28
  3.2 pTAT-XIAP 基因测序结果及分析  28-34
  3.3 目的蛋白TAT-XIAP 表达形式的鉴定  34-36
  3.4 目的蛋白TAT-XIAP 的纯化  36-37
  3.5 目的蛋白 TAT-XIAP 的 western blot 鉴定  37-38
  3.6 MTT 法检测 TAT-XIAP 融合蛋白对 CEN2 细胞生长的影响  38-39
  3.7 TAT-XIAP 融合蛋白血脑屏障穿透功能的鉴定  39-40
4 讨论  40-43
5 结论  43
参考文献  43-47
综述  47-63
  综述参考文献  56-63
攻读硕士学位期间发表的论文目录  63-64
致谢  64

融合蛋白TAT-XIAP的原核表达及其生物学活性的初步鉴定

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