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携带HSV-2 gB CTL表位的gD抗原制备及其免疫效果评估

作　者: 李君丽
导　师: 于三科；王希良
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 单纯疱疹病毒 糖蛋白D 糖蛋白B 杆状病毒表达系统 CTL表位
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus 2, HSV-2)为双链DNA病毒,属疱疹病毒科,感染可引起生殖器疱疹。HSV-2感染在全球普遍存在,发展中国家的形势更为严峻。HSV-2还可增加艾滋病和宫颈癌的感染机率。疫苗在预防和治疗HSV-2感染和复发中具有重要的作用。目前的疫苗研制工作主要集中在HSV-2糖蛋白上。HSV-2表面的11种糖蛋白是其主要免疫原,其中的糖蛋白D(glycoprotein D, gD)和糖蛋白B(glycoprotein B, gB)是亚单位疫苗研究的热点。gD具有高同源性和保守性,是HSV-2最主要的保护性抗原。gB可诱导产生中和抗体并能诱发细胞毒性T细胞反应,CTL表位与MHCⅠ类分子结合,被CD8+ T细胞表面受体识别,激发细胞免疫反应,这种免疫反应是抗HSV-2免疫的重要组成部分。本研究将HSV-2主要免疫原gD与gB上两种CTL表位连接构建重组基因gD-gBCTL,分别在杆状病毒表达系统和原核表达系统中进行表达,并对原核表达的重组蛋白的免疫效果进行初步评价。在杆状病毒表达系统中,以构建的重组基因为模板,分别扩增gD基因和gD-gBCTL基因,连接载体pFastBac1构建重组供体质粒,转化DH10BacTM感受态,通过转座获得重组穿梭质粒,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,用获得的两种重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白。经过筛选重组穿梭质粒、优化表达条件,使gD和gD-gBCTL蛋白都得到了较高量的表达,为下一步纯化这两种蛋白,研究它们的免疫效果奠定了基础。在原核表达系统中,构建重组基因表达质粒pET-22b(+)-gD-gBCTL,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,His TrapTM HP柱纯化得到可溶性表达的重组蛋白。将该重组蛋白结合不同佐剂,以不同方式免疫Balb/c小鼠,测定抗体效价,初步评价添加CTL表位后重组蛋白的体液免疫效果,并建立动物攻毒模型,评价重组蛋白的免疫保护性,结果表明该重组蛋白具有较强的免疫保护作用。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
文献综述  11-17
  第一章 单纯疱疹病毒Ⅱ型的研究进展  11-17
    1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型  11-12
    1.2 HSV-2 的感染流行现状  12
    1.3 HSV-2 感染过程  12-13
    1.4 HSV-2 感染与免疫  13-14
      1.4.1 HSV-2 感染与天然免疫  13-14
      1.4.2 HSV-2 感染与获得性免疫  14
    1.5 HSV-2 的疫苗研究概况  14-16
    1.6 展望  16-17
试验研究  17-65
  第二章 HSV-2 在Vero 细胞上的培养、收获和病毒毒力测定  17-23
    2.1 材料  17-18
      2.1.1 细胞与病毒株  17
      2.1.2 主要试剂与仪器  17-18
      2.1.3 主要试剂的配制  18
    2.2 方法  18-20
      2.2.1 Vero 细胞的复苏、冻存及培养  18-19
      2.2.2 HSV-2 333 株在Vero 细胞中的培养与收获  19
      2.2.3 HSV-2 333 株的纯化  19
      2.2.4 HSV-2 333 株半数组织感染量（TCID50）的测定  19-20
      2.2.5 HSV-2 333 株全病毒灭活与蛋白定量  20
    2.3 结果  20-21
      2.3.1 HSV-2 333 株感染Vero 细胞病变观察  20
      2.3.2 HSV-2 333 株病毒滴度测定结果  20-21
      2.3.3 HSV-2 333 株灭活后蛋白含量测定结果  21
    2.4 讨论  21-23
  第三章 HSV-2 gD 融合gB CTL 表位重组蛋白gD-gBCTL 与gD 在杆状病毒表达系统中的表达  23-41
    3.1 材料  23-26
      3.1.1 基因、菌株与载体  23
      3.1.2 实验用细胞  23
      3.1.3 主要试剂  23-24
      3.1.4 主要仪器  24
      3.1.5 主要试剂的配制  24-26
    3.2 方法  26-35
      3.2.1 引物的设计与合成  26
      3.2.2 目的基因的扩增  26
      3.2.3 目的基因的鉴定和胶回收  26-27
      3.2.4 连接克隆载体pMD18-T  27-28
      3.2.5 DH5α感受态细胞的制备  28
      3.2.6 连接产物转化E.coli DH5α  28
      3.2.7 转化后菌落PCR 鉴定  28-29
      3.2.8 重组质粒的提取  29
      3.2.9 目的基因连接供体质粒pFastBac1  29-30
      3.2.10 DH10Bac~(TM) 感受态细胞的制备  30
      3.2.11 转化DH10Bac~(TM) 与鉴定  30-31
      3.2.12 重组杆粒Bacmid-gD 与Bacmid-gD-gBCTL 的提取  31
      3.2.13 PCR 鉴定重组杆粒  31-32
      3.2.14 昆虫细胞的复苏、传代培养与冻存  32-33
      3.2.15 重组杆粒转染昆虫细胞  33-34
      3.2.16 重组杆状病毒的收获  34
      3.2.17 重组杆状病毒的传代培养  34
      3.2.18 重组杆状病毒毒种的保存  34
      3.2.19 病毒毒力的测定  34
      3.2.20 目的蛋白表达条件的优化  34-35
      3.2.21 目的蛋白的Western blot 鉴定  35
      3.2.22 目的蛋白的大量表达  35
    3.3 结果  35-39
      3.3.1 目的基因的扩增  35-36
      3.3.2 目的基因连接供体质粒pFastBac1 的酶切鉴定  36
      3.3.3 重组杆粒的鉴定  36-37
      3.3.4 重组杆状病毒感染 sf9 昆虫细胞  37
      3.3.5 重组杆状病毒毒力测定  37-38
      3.3.6 目的蛋白表达条件的优化  38-39
      3.3.7 目的蛋白的Western blot 鉴定  39
    3.4 讨论  39-41
  第四章 重组蛋白gD-gBCTL 的原核表达与纯化  41-53
    4.1 材料  41-43
      4.1.1 基因、菌株与载体  41
      4.1.2 主要试剂  41-42
      4.1.3 主要仪器  42
      4.1.4 主要试剂的配制  42-43
    4.2 方法  43-48
      4.2.1 引物的设计与合成  43
      4.2.2 目的基因的扩增  43-44
      4.2.3 目的基因的鉴定和胶回收  44
      4.2.4 PCR 产物连接克隆载体pMD18-T  44
      4.2.5 连接产物转化E.coli DH5α  44-45
      4.2.6 转化后菌落PCR 鉴定  45
      4.2.7 目的基因表达载体的构建  45-46
      4.2.8 表达载体的酶切鉴定  46
      4.2.9 E. coli BL21 感受态细胞的制备  46
      4.2.10 重组蛋白的诱导表达  46-47
      4.2.11 重组蛋白的Western blot 鉴定  47
      4.2.12 重组蛋白的纯化  47
      4.2.13 重组蛋白的定量测定  47-48
    4.3 结果  48-52
      4.3.1 gD-gBCTL 基因的扩增  48
      4.3.2 表达载体的酶切鉴定  48
      4.3.3 gD-gBCTL 蛋白的诱导表达  48-50
      4.3.4 gD-gBCTL 蛋白的Western blot 鉴定  50
      4.3.5 gD-gBCTL 蛋白的纯化结果  50-51
      4.3.6 gD-gBCTL 蛋白的定量测定结果  51-52
    4.4 讨论  52-53
  第五章 原核表达重组蛋白 gD-gBCTL 免疫效果的初步评价  53-65
    5.1 材料  53-54
      5.1.1 抗原与病毒株  53
      5.1.2 实验动物  53
      5.1.3 主要试剂  53
      5.1.4 主要仪器  53
      5.1.5 主要试剂的配制  53-54
    5.2 方法  54-57
      5.2.1 实验动物分组及免疫程序  54-55
      5.2.2 动物血清与阴道灌洗液的制备  55
      5.2.3 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体  55
      5.2.4 ELISA 方法检测阴道灌洗液中sIgA 抗体  55
      5.2.5 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体亚型  55-56
      5.2.6 ELISA 方法检测血清中IFN-γ的含量  56
      5.2.7 血清中和实验  56-57
      5.2.8 小鼠攻毒模型的建立  57
      5.2.9 小鼠攻毒方案  57
      5.2.10 攻毒后病变观察、体重称量与病毒含量测定  57
    5.3 结果  57-63
      5.3.1 ELISA 方法检测小鼠血清中IgG 抗体效价  57-58
      5.3.2 ELISA 方法检测阴道灌洗液中sIgA 抗体效价  58-59
      5.3.3 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体亚型  59
      5.3.4 ELISA 方法检测血清中IFN-γ的含量  59-60
      5.3.5 血清中和抗体  60
      5.3.6 小鼠攻毒模型建立结果  60-61
      5.3.7 小鼠攻毒试验结果  61-63
    5.4 讨论  63-65
结论  65-66
参考文献  66-72
英文缩略词  72-73
致谢  73-75
作者简介  75

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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