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人SCL基因重组腺病毒表达载体的构建

作 者: 周建民
导 师: 丁国富
学 校: 石河子大学
专 业: 外科学
关键词: 人SCL基因 pDC315-EGFP真核表达载体 PCR 重组腺病毒载体 转染
分类号: R346
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 22次
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内容摘要


目的:构建含人SCL基因的pDC315-SCL重组腺病毒载体,为下一步研究SCL基因在ICC样细胞的功能奠定基础。方法:从含有人SCL基因的质粒中,采用PCR方法扩增SCL基因,将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换,其产物转化细菌感受态细胞,对克隆产物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆产物进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的重组穿梭质粒。pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)El,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率。结果:PCR扩增的SCL基因片段长度为1036bp,测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭质粒真核表达载体中。pDC315-SCL重组腺病毒载体通过PCR结果证明和Western Blot检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010PFU/mL,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率可达95%。结论:成功构建了含人SCL基因真核表达载体pDC315-EGFP-SCL和应用AdMax载体系统成功构建含人SCL基因重组腺病毒载体pDC315-SCL。pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很高的转染效率。

全文目录


中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
英文缩略词  8-9
前言  9-11
材料与方法  11-25
  1 材料  11-15
  2 技术路线  15-16
  3 方法  16-22
  4 增重组腺病毒  22
  5 化重组腺病毒  22-23
  6 组腺病毒的滴度测定,采用终点稀释法进行  23
  7 糖环境下豚鼠膀肤Cjaal样间质细胞的分离纯化培养  23-25
结果  25-30
  1 质粒pDC315-EGFP酶切鉴定  25
  2 人SCL基因的扩增PCR产物鉴定  25-26
  3 含有人SCL基因的pDC315-EGFP阳性克隆 鉴定  26-27
  4 含有人SCL基因的pDC315-EGFP阳性克隆测序鉴定  27-28
  5 重组腺病毒pDC315-SCL的包装  28
  6 重组腺病毒pDC315-SCL的鉴定  28-29
  7 重组腺病毒pDC315-SCL的滴度鉴定  29
  8 人SCL基因的重组腺病毒载体转染豚鼠Cajal样间质细胞  29-30
讨论  30-36
  1 豚鼠膀胱Cajal样间质细胞与其SCF/C-kit信号通路关系  30-32
  2 人SCL基因真核表达载体的构建  32
  3 感染HEK293细胞重组扩增含人SCL基因重组腺病毒  32-33
  4 重组腺病毒滴度测定  33-34
  5 含人SCL基因重组腺病毒表达载体的构建和转染豚鼠膀胱Cajal样细胞  34-36
结论  36-37
展望  37-38
附图  38-43
参考文献  43-46
文献综述  46-51
  参考文献  48-51
致谢  51-52
作者简历  52-53
导师评阅表  53

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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