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经IL-10基因转化的大肠杆菌治疗小鼠结肠炎的实验研究
作 者: 顾秋平
导 师: 白爱平
学 校: 南昌大学
专 业: 内科学
关键词: mIL-10 转化 大肠杆菌 生物学活性 IL-10 结肠炎 炎症性肠病 基因治疗
分类号: R574.62
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
第一部分IL-10基因转化大肠杆菌的研究目的:利用小鼠白介素-10基因转化大肠杆菌,使所转化的细菌表达并分泌IL-10。方法:根据mIL-10的基因序列及大肠杆菌载体的多克隆位点,经过优化修饰mIL-10基因序列,合成新mIL-10编码基因序列,连接至原核表达载体pET32a+并测序,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段的大小。用基因工程技术将含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表达载体Origami B(DE3),在体外经IPTG诱导表达,选择最佳的诱导条件。Western blot对目的蛋白进行鉴定,并探讨IL-10对LPS所诱导RAW264.7激活的抑制作用。结果:优化的mIL-10基因序列在氨基酸翻译上同源性为100%,重组的原核表达载体OrigamiB (DE3)/pET32a+mIL-10在体外可以高效表达,最佳的诱导时间为IPTG 1mmol诱导3小时表达量最大,细菌培养基中可检测目的蛋白的表达,浓度为3.96ng/ml。Western blot检测目的蛋白具有良好的抗原反应性,IL-10能够有效抑制LPS对RAW264.7的激活作用,减少TNF的释放。结论:mIL-10转化大肠杆菌能表达具有生物学效应的IL-10。第二部分IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究目的:研究经IL-10基因转化的大肠杆菌对DSS小鼠结肠炎肠道炎症的影响,并探讨其相关机制。方法:将IL-10基因转化的大肠杆菌简称为E.coli-IL-10,空质粒转化菌则简称为E.coli0;将小鼠随机分成6组:正常组对照组,DSS组,DSS+E.coli/IL-10组,DSS+E.coli0组,正常鼠+E.coli/IL-10组以及正常鼠+E.coli组。建立小鼠急性DSS结肠炎模型。自小鼠模型建立第1天开始,DSS+E.coli/IL-10组和正常鼠+E.coli/IL-10分别给予重组IL-10大肠杆菌1×108cfu/天灌胃至实验结束,DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分别给予空质粒大肠杆菌灌胃至实验结束,正常对照组以及DSS组给于同等培养基灌胃至实验结束。每天观察各组疾病活动指数(DAI),并在实验结束后检测各组小鼠炎症肠段肿瘤坏死因子(TNF)和髓过氧化物酶(MPO)等的含量,并测定小鼠结肠核因子(NF)-KB P65表达。结果:1.DAI评分:DSS-E.coli/IL-10组小鼠的DAI评分与DSS组和DSS-E.coli0两组相比得分明显较低(P<0.05), DSS-Ecoli0组与DSS组之间DAI得分无明显差异(P>0.05);对照组与正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10间3组DAI得分均为0。2.组织学评分:DSS-Ecoli/IL-10 (6.22±3.30)低于DSS组和DSS-Ecoli0[(10.54±4.15)和(10.0±3.00)](P<0.05),后两者直接得分无统计学差异(P>0.05);饮用DSS水各组均高于对照组(0.88±0.31)(P<0.05)。3.MPO活性:DSS+E.coli/IL-10组(2.35±0.39)明显低于DSS组和DSS+Ecoli0组[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P<0.05),高于其他3组(P>0.05)。4.组织匀浆TNF含量:DSS组(237.85±47.01)与DSS-Ecoli0(239.81±50.38)组之间无明显差异(P>0.05),高于其他4组(P<0.05);DSS-Ecoli/IL-10组(172.46±66.71)低于DSS组以及DSS-Ecoli0(?)且(P<0.05),高于对照组(P>0.05)。5.结肠粘膜NF-kB表达:DSS-Ecoli/IL-10组小鼠粘膜中NF-kB的活性明显低于DSS组和DSS-Ecoli0组(P<0.05),饮用DSS水的3组小鼠的粘膜NF-kB活性明显比饮用自来水的3组小鼠活性高,DSS组与DSS-Ecoli0两组间NF-kB活性无显著差异(P>0.05)。结论:利用经IL-10基因转化的大肠杆菌可以明显缓解DSS小鼠的结肠炎症损伤,减低MPO活性、抑制炎症肠段炎症细胞NF-kB的活化及炎性细胞因子的分泌。利用基因工程技术结合肠道共栖菌表达IL-10可以为IBD治疗提供一个新的方法。
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全文目录
摘要 3-6 ABSTRACT 6-13 引言 13-15 第1部 IL-10基因转化大肠杆菌的研究 15-34 材料与方法 15-25 1. Origami B(DE3)-pET32a+/mIL-10表达载体的构建 15-20 2. 实验方法 20-21 3. 重组IL-10表达的检测 21-24 4. 重组IL-10的Western blotting检测 24 5. 重组IL-10的生物活性检测 24-25 6. 统计学处理 25 结果 25-30 1. 小鼠IL-10基因的获得 25-27 2. 重组质粒pET32a/IL-10的酶切鉴定 27 3. 重组大肠杆菌的诱导表达 27-28 4. 重组大肠杆菌pET32a/IL-10诱导表达培养基mIL-10浓度 28-29 4.1 不同诱导时间对重组大肠杆菌培养基目的蛋白表达影响 28-29 4.2 Elisa法测定诱导表达3小时后培养基中IL-10浓度 29 5. 重组mIL-10的Western Bloting检测 29-30 6. 重组mIL-10生物活性的测定 30 讨论 30-32 参考文献 32-34 第2部分 IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究 34-50 材料与方法 34-38 一、实验试剂和仪器 34-35 二、实验对象与分组 35 三、实验方法 35-38 结果 38-42 一、小鼠DSS结肠炎的观察 38-41 二、各组结肠组织MPO活性 41 三、结肠组织中TNF表达的检测 41-42 四、免疫组化检测结果 42 讨论 42-46 参考文献 46-50 全文总结 50-51 致谢 51-52 附图 52-55 硕士在读期间成果 55-56 综述 56-64 参考文献 62-64
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 消化系及腹部疾病 > 肠疾病 > 大肠疾病 > 结肠疾病
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