学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

经IL-10基因转化的大肠杆菌治疗小鼠结肠炎的实验研究

作 者: 顾秋平
导 师: 白爱平
学 校: 南昌大学
专 业: 内科学
关键词: mIL-10 转化 大肠杆菌 生物学活性 IL-10 结肠炎 炎症性肠病 基因治疗
分类号: R574.62
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 18次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


第一部分IL-10基因转化大肠杆菌的研究目的:利用小鼠白介素-10基因转化大肠杆菌,使所转化的细菌表达并分泌IL-10。方法:根据mIL-10的基因序列及大肠杆菌载体的多克隆位点,经过优化修饰mIL-10基因序列,合成新mIL-10编码基因序列,连接至原核表达载体pET32a+并测序,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段的大小。用基因工程技术将含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表达载体Origami B(DE3),在体外经IPTG诱导表达,选择最佳的诱导条件。Western blot对目的蛋白进行鉴定,并探讨IL-10对LPS所诱导RAW264.7激活的抑制作用。结果:优化的mIL-10基因序列在氨基酸翻译上同源性为100%,重组的原核表达载体OrigamiB (DE3)/pET32a+mIL-10在体外可以高效表达,最佳的诱导时间为IPTG 1mmol诱导3小时表达量最大,细菌培养基中可检测目的蛋白的表达,浓度为3.96ng/ml。Western blot检测目的蛋白具有良好的抗原反应性,IL-10能够有效抑制LPS对RAW264.7的激活作用,减少TNF的释放。结论:mIL-10转化大肠杆菌能表达具有生物学效应的IL-10。第二部分IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究目的:研究经IL-10基因转化的大肠杆菌对DSS小鼠结肠炎肠道炎症的影响,并探讨其相关机制。方法:将IL-10基因转化的大肠杆菌简称为E.coli-IL-10,空质粒转化菌则简称为E.coli0;将小鼠随机分成6组:正常组对照组,DSS组,DSS+E.coli/IL-10组,DSS+E.coli0组,正常鼠+E.coli/IL-10组以及正常鼠+E.coli组。建立小鼠急性DSS结肠炎模型。自小鼠模型建立第1天开始,DSS+E.coli/IL-10组和正常鼠+E.coli/IL-10分别给予重组IL-10大肠杆菌1×108cfu/天灌胃至实验结束,DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分别给予空质粒大肠杆菌灌胃至实验结束,正常对照组以及DSS组给于同等培养基灌胃至实验结束。每天观察各组疾病活动指数(DAI),并在实验结束后检测各组小鼠炎症肠段肿瘤坏死因子(TNF)和髓过氧化物酶(MPO)等的含量,并测定小鼠结肠核因子(NF)-KB P65表达。结果:1.DAI评分:DSS-E.coli/IL-10组小鼠的DAI评分与DSS组和DSS-E.coli0两组相比得分明显较低(P<0.05), DSS-Ecoli0组与DSS组之间DAI得分无明显差异(P>0.05);对照组与正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10间3组DAI得分均为0。2.组织学评分:DSS-Ecoli/IL-10 (6.22±3.30)低于DSS组和DSS-Ecoli0[(10.54±4.15)和(10.0±3.00)](P<0.05),后两者直接得分无统计学差异(P>0.05);饮用DSS水各组均高于对照组(0.88±0.31)(P<0.05)。3.MPO活性:DSS+E.coli/IL-10组(2.35±0.39)明显低于DSS组和DSS+Ecoli0组[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P<0.05),高于其他3组(P>0.05)。4.组织匀浆TNF含量:DSS组(237.85±47.01)与DSS-Ecoli0(239.81±50.38)组之间无明显差异(P>0.05),高于其他4组(P<0.05);DSS-Ecoli/IL-10组(172.46±66.71)低于DSS组以及DSS-Ecoli0(?)且(P<0.05),高于对照组(P>0.05)。5.结肠粘膜NF-kB表达:DSS-Ecoli/IL-10组小鼠粘膜中NF-kB的活性明显低于DSS组和DSS-Ecoli0组(P<0.05),饮用DSS水的3组小鼠的粘膜NF-kB活性明显比饮用自来水的3组小鼠活性高,DSS组与DSS-Ecoli0两组间NF-kB活性无显著差异(P>0.05)。结论:利用经IL-10基因转化的大肠杆菌可以明显缓解DSS小鼠的结肠炎症损伤,减低MPO活性、抑制炎症肠段炎症细胞NF-kB的活化及炎性细胞因子的分泌。利用基因工程技术结合肠道共栖菌表达IL-10可以为IBD治疗提供一个新的方法。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
引言  13-15
第1部 IL-10基因转化大肠杆菌的研究  15-34
  材料与方法  15-25
    1. Origami B(DE3)-pET32a+/mIL-10表达载体的构建  15-20
    2. 实验方法  20-21
    3. 重组IL-10表达的检测  21-24
    4. 重组IL-10的Western blotting检测  24
    5. 重组IL-10的生物活性检测  24-25
    6. 统计学处理  25
  结果  25-30
    1. 小鼠IL-10基因的获得  25-27
    2. 重组质粒pET32a/IL-10的酶切鉴定  27
    3. 重组大肠杆菌的诱导表达  27-28
    4. 重组大肠杆菌pET32a/IL-10诱导表达培养基mIL-10浓度  28-29
      4.1 不同诱导时间对重组大肠杆菌培养基目的蛋白表达影响  28-29
      4.2 Elisa法测定诱导表达3小时后培养基中IL-10浓度  29
    5. 重组mIL-10的Western Bloting检测  29-30
    6. 重组mIL-10生物活性的测定  30
  讨论  30-32
  参考文献  32-34
第2部分 IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究  34-50
  材料与方法  34-38
    一、实验试剂和仪器  34-35
    二、实验对象与分组  35
    三、实验方法  35-38
  结果  38-42
    一、小鼠DSS结肠炎的观察  38-41
    二、各组结肠组织MPO活性  41
    三、结肠组织中TNF表达的检测  41-42
    四、免疫组化检测结果  42
  讨论  42-46
  参考文献  46-50
全文总结  50-51
致谢  51-52
附图  52-55
硕士在读期间成果  55-56
综述  56-64
  参考文献  62-64

相似论文

  1. 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制,S154.3
  2. 军曹鱼生长激素基因(GH)的克隆和表达,Q786
  3. 王嘉麟学术思想和临床经验总结及治疗疡性结肠炎的方药分析研究,R259
  4. 小学美术教学中联想思维的转化训练,G623.75
  5. 粤东农村地区初中数学学业不良生的现状与转化策略研究,G633.6
  6. 高中数学学困生的有效转化策略探究,G633.6
  7. 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
  8. 虾池一株微藻对尿素和甲硫氨酸利用效率的研究,S968.22
  9. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  10. rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究,S668.4
  11. 甜菊苷的定向转化及产物甜茶苷的分离纯化,S566.9
  12. 功能化纳米二氧化钛多孔材料的制备、表征及性能研究,TB383.1
  13. 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
  14. 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
  15. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  16. 鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析,S852.61
  17. 海藻糖改善枯草芽孢杆菌电转化方法的研究,Q78
  18. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  19. 基于遗传算法优化的BP网络对生物柴油制备工艺的优化,TE667
  20. 小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)快速检测体系的建立及应用,TS207.4
  21. 水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建,S435.111.42

中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 消化系及腹部疾病 > 肠疾病 > 大肠疾病 > 结肠疾病
© 2012 www.xueweilunwen.com