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建立分别具有CYP2C9和CYP2D6活性的微生物模型

作　者: 林立红
导　师: 黄海华
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 微生物转化小克银汉霉菌细胞色素P450酶2C9和2D6 酶抑制剂液相色谱-多级质谱分析
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本文采用菌株筛选、系统优化、抑制剂研究和药物相互作用等方法分别建立了具有CYP2C9和CYP2D6活性的微生物模型，采用微生物转化法制备了格列本脲和吲哚美辛的药物代谢产物对照品。一、建立具有CYP2C9活性的微生物模型1．选用3种CYP2C9代谢的药物格列本脲、双氯芬酸和吲哚美辛为转化底物，利用液相色谱-多级质谱联用技术检测药物代谢产物的种类和产率，检测小克银汉霉AS 3.910、AS 3.153、AS 3.2028、AS 3.156和AS 3.2028对各底物的转化能力，筛选模型菌株。利用正交试验优化转化系统中影响目标产物产率的主要因素，发现短刺小克银汉霉AS3.910在麦麸培养基初始pH6.5条件下对3种底物的转化能力最强，由此初步建立了具有CYP2C9活性的微生物模型。2．选用CYP2C9抑制剂丙戊酸、磺胺苯吡唑和苯溴马隆分别作用于含CYP2C9底物的短刺小克银汉霉AS 3.910转化系统，在抑制剂作用下模型菌株转化CYP2C9底物甲苯磺丁脲、双氯芬酸和吲哚美辛的能力明显下降，从细胞水平上验证短刺小克银汉霉AS3.910含有CYP2C9同工酶。3．将CYP2C9底物甲苯磺丁脲、双氯芬酸和吲哚美辛两两一组同时投加到短刺小克银汉霉AS 3.910的预转化液中，检测3底物通过模型菌株显示出的药物相互作用。结果表明各底物之间存在不同程度的相互抑制，进一步确证了短刺小克银汉霉AS 3.910含有CYP2C9同工酶。二、建立具有CYP2D6活性的微生物模型1．以CYP2D6探针药物右美沙芬为底物，筛查了59株丝状真菌转化右美沙芬形成O-去甲基产物的能力，发现短刺小克银汉霉AS 3.153的转化能力最强，O-去甲基右美沙芬的产率为82.7％，选择该菌株深入研究。选用CYP2D6底物右美沙芬、普罗帕酮和美托洛尔，采用正交试验方法对影响目标产物产率的主要因素优化，显示短刺小克银汉霉AS 3.153在麦麸培养基初始pH 6.5条件下对3种底物的转化能力最强，由此初步建立了具有CYP2D6活性的微生物模型。2．选用CYP2D6抑制剂奎尼丁作用于短刺小克银汉霉AS 3.153，在抑制剂作用下其转化右美沙芬、普罗帕酮和美托洛尔的能力明显下降；将3种CYP2D6底物两两一组同时投药于短刺小克银汉霉AS 3.153预转化液中，结果表明各底物之间存在不同程度的相互抑制，进一步证明了短刺小克银汉霉AS 3.153含有CYP2D6同工酶。三、利用微生物转化法制备药物代谢产物对照品采用本文建立的CYP2C9微生物转化模型，制备格列本脲与吲哚美辛的微生物转化液，采用柱层析和半制备液相色谱等分离手段，分离目标代谢产物，通过ESI-MSⁿ分析、¹H NMR和¹³C-NMR谱鉴定结构，确定所得代谢产物分别为4′-反式-环己基羟化格列本脲、3′-顺式-环己基羟化格列本脲、O-去甲基吲哚美辛、N-去氯苯甲酰基吲哚美辛和O-去甲基-N-去氯苯甲酰基吲哚美辛，显示出微生物转化模型在制备人体药物代谢对照品方面的特有优势。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一章引言  13-18
  1.1 药物代谢研究  13
  1.2 药物代谢研究方法  13-14
    1.2.1 体内研究方法  13
    1.2.2 体外研究方法  13-14
  1.3 微生物转化法  14-15
    1.3.1 哺乳动物药物代谢微生物模型的建立及优势  14-15
    1.3.2 微生物转化的基本方法及其应用  15
  1.4 药物代谢酶细胞色素P450简介  15-16
  1.5 真菌细胞色素P450  16-17
  1.6 论文研究目标  17-18
第二章实验材料与基本方法  18-21
  2.1 微生物  18
  2.2 培养基  18
  2.3 药品与试剂  18-19
  2.4 仪器设备  19
  2.5 微生物转化系统  19-21
    2.5.1 预转化液的制备  19-20
    2.5.2 微生物转化  20
    2.5.3 制备性转化系统  20-21
第三章建立具有CYP2C9活性的微生物模型  21-35
  3.1 转化药物  21-22
  3.2 方法  22-23
    3.2.1 建立具有CYP2C9活性的微生物转化模型  22
      3.2.1.1 小克银汉霉菌转化CYP2C9底物能力的测试  22
      3.2.2.2 建立具有CYP2C9活性的小克银汉霉菌微生物模型  22
    3.2.2 转化产物的检测  22-23
      3.2.2.1 分析样品预处理  22
      3.2.2.2 LC-MS~n检测条件  22-23
  3.3 结果  23-33
    3.3.1 药物转化产物的LC-MS~n分析  23-26
      3.3.1.1 格列本脲转化产物的LC-MS~n分析  23-24
      3.3.1.2 吲哚美辛转化产物的LC-MS~n分析  24-25
      3.3.1.3 双氯芬酸转化产物的LC-MS~n分析  25-26
    3.3.2 小克银汉霉菌转化CYP2C9底物能力的测试  26-31
      3.3.2.1 小克银汉霉菌转化吲哚美辛能力的测试  26-28
      3.3.2.2 小克银汉霉菌转化格列本脲能力的测试  28-30
      3.3.2.3 小克银汉霉菌转化双氯芬酸能力的测试  30-31
    3.3.3 建立小克银汉霉菌模拟CYP2C9代谢的模型  31-33
  3.4 讨论  33-35
第四章短刺小克银汉霉AS 3.910的CYP2C9同工酶抑制研究  35-45
  4.1 CYP2C9抑制剂简介  35-36
  4.2 方法  36-38
    4.2.1 短刺小克银汉霉AS 3.910中CYP2C9同工酶研究  36-37
    4.2.2 三种CYP2C9底物的药物相互作用  37
    4.2.3 甲苯磺丁脲转化产物LC-MS~n检测条件  37-38
    4.2.4 甲苯磺丁脲转化产物HPLC色谱分析条件  38
  4.3 结果  38-43
    4.3.1 甲苯磺丁脲转化产物LC-MS~n和HPLC分析  38-40
    4.3.2 短刺小克银汉霉AS 3.910的CYP2C9同工酶抑制研究  40-42
    4.3.3 CYP2C9底物的药物相互作用  42-43
  4.4 讨论  43-45
第五章微生物转化法制备格列本脲和吲哚美辛代谢产物对照品  45-52
  5.1 制备格列本脲和吲哚美辛的转化产物  45
  5.2 转化产物的分离与鉴定  45-51
    5.2.1 吲哚美辛转化产物的分离  45-48
      5.2.1.1 柱层析  45
      5.2.1.2 制备液相色谱分离  45-46
      5.2.1.3 转化产物的结构鉴定  46-48
    5.2.2 格列本脲转化产物的分离  48-51
      5.2.2.1 柱层析  48
      5.2.2.1 制备液相色谱  48-49
      5.2.2.3 转化产物的结构鉴定  49-51
  5.3 讨论  51-52
第六章建立具有CYP2D6活性的微生物模型  52-67
  6.1 转化药物  52-53
  6.2 方法  53-55
    6.2.1 筛选CYP2D6模型菌株  53
    6.2.2 初步建立具有CYP2D6活性的微生物模型  53-54
    6.2.3 模型菌株中CYP2D6同工酶初步研究  54
    6.2.4 三种CYP2D6底物的药物相互作用  54-55
    6.2.5 转化产物的检测  55
      6.2.5.1 分析样品预处理  55
      6.2.5.2 LC-MS~n检测条件  55
  6.3 结果  55-65
    6.3.1 药物转化产物的LC-MS~n分析  55-59
      6.3.1.1 右美沙芬转化产物的LC-MS~n分析  55-56
      6.3.1.2 普罗帕酮转化产物的LC-MS~n分析  56-58
      6.3.1.3 美托洛尔转化产物的LC-MS~n分析  58-59
    6.3.2 筛选具有CYP2D6活性的模型菌株  59
    6.3.3 初步建立具有CYP2D6活性的微生物模型  59-63
    6.3.4 短刺小克银汉霉AS 3.153中CYP2D6同工酶研究  63-64
    6.3.5 三种CYP2D6底物的药物相互作用  64-65
  6.4 讨论  65-67
第七章结论  67-75
参考文献  75-79
致谢  79-80
作者简历  80
学位论文期间发表文章  80

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