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耐铝酵母菌的分离及土生隐球酵母铝响应基因的鉴定

作 者: 王阁奇
导 师: 陈丽梅
学 校: 昆明理工大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茶园酸性土壤  土生隐球酵母 SSH文库
分类号: S154.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 7次
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内容摘要


在酸性土壤中主要以对生物有毒的A13+形式存在,因此,铝毒害是酸性土壤中影响农作物产量最主要的毒害因子之一。研究生物耐铝机理是解决酸性土壤上铝毒害问题的基础。微生物生长快,周期短,是研究耐铝机理比较好的模式材料。分离具有较高耐铝能力的微生物,鉴定铝胁迫响应基因,研究微生物的耐铝机理,可以为改良铝敏感作物提供基因资源,为植物耐铝机制的研究提供参考。因此本研究通过分离耐铝能力较强的菌株,并利用抑制消减杂交技术鉴定土生隐球酵母铝胁迫响应基因,探讨耐铝毒的分子机理。主要研究结果如下:采集云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤,在pH3.5条件下,含20mmol.L-1 Al3+的GM固体培养基上分离获得4株耐铝菌株,分别命名为1-1,1-28,3-4,3-13。通过形态观察及基于真菌ITS和26S rDNA D1/D2基因分子进化系统分析,初步鉴定:1-1菌株可能为Cryptococcus humicola,1-28菌株可能为Cryptococcus rajasthanensis,3-4菌株可能为Cryptococcus laurentii,3-13菌株可能为Rhodotorula mucilaginosa。将测序所得的ITS和26S rDNA D1/D2基因序列提交到GenBank数据库,获得相应的Accession numbers, ITS分别为:HM459599 (1-1), HM459601 (1-28), HM469461 (3-4), HM469463 (3-13); 26S rDNA D1/D2分别为:HM459598 (1-1), HM459600 (1-28), HM469460 (3-4), HM469462 (3-13).对4株菌株进行耐铝能力分析,得到如下结果:在GM液体培养基中,1-1可以在含200mmol.L-1 Al3+的培养基中生长,1-28,3-4,3-13均可在100mmol.L-1Al3+的培养基中生长。在GM固体培养基中,4株菌均可在含150mmol.L-1 Al3+的培养基上生长,其中,1-1,1-28在含200mmol.L-1 Al3+的培养基上仍能生长,但生长速度受到明显抑制。通过流式细胞仪分析了在0、20、50、100、200mmol.L-1 Al3+条件下,土生隐球酵母的凋亡情况。随着铝浓度的增加,凋亡细胞明显增多;在100mmol.L-1时出现明显的凋亡峰;高浓度下细胞受到毒害加深,细胞有变小趋势。在含20mmol.L-1铝的培养基中培养48h后剩余的铝含量在98%以上,说明吸收和吸附并不是土生隐球酵母耐铝机理的主要机制。测定了隐球酵母在20 mmol.L-1铝胁迫下的生理指标。随着培养时间的增长,总蛋白含量恒定;PC含量呈现显著下降趋势;SOD活性总体先下降后上升;可溶性糖含量先下降随后又恢复正常;丙二醛含量呈上升趋势。利用抑制消减杂交技术构建土生隐球酵母20mmol.L-1铝胁迫下的正向SSH cDNA文库,挑选1200个阳性克隆组成文库。PCR检测发现文库插入片段主要分布在0.2~0.8 kp之间。从SSH cDNA文库中选出插入片段大于200bp的克隆进行测序,测序结果分析后获得了252条EST序列,剔除重复序列后获得141条差异EST序列。己知功能的EST序列占46%,其中6%与能量相关,代谢相关的有16%,与胁迫防御相关的有1%,与蛋白合成和加工相关的占16%,参与信号转导的为3%,细胞骨架相关的为6%;功能未知的EST序列占19%;获得的新EST序列占35%。通过RT-PCR分析验证文库中14个基因的表达水平,结果表明:ATP:ADP反向转运体,△12脂肪酸去饱和酶,果糖二磷酸醛缩酶,Rhol GTP酶,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,液泡蛋白基因在铝胁迫下呈不同程度的上调表达。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
插图和附表清单  11-13
缩略词  13-14
第一章 文献综述  14-22
  1.1 研究背景  14
  1.2 耐微生物的分离  14-16
  1.3 微生物的耐铝机制的研究进展  16-21
    1.3.1 酵母耐铝机制的研究进展  16-17
    1.3.2 假单胞菌耐铝机制  17-19
    1.3.3 菌根真菌的耐铝机制  19-20
    1.3.4 其它微生物耐铝机制  20
    1.3.5 小结  20-21
  1.4 研究目的和意义  21-22
第二章 耐铝微生物的分离纯化及其鉴定  22-40
  2.1 材料与方法  22-24
    2.1.1 土壤样品的采集  22
    2.1.2 培养基的配制  22
    2.1.3 菌株分离纯化  22-23
    2.1.4 菌落及菌体形态观察  23
    2.1.5 酵母基因组DNA的提取  23
    2.1.6 ITS和26S rDNAD1/D2片段的PCR扩增  23-24
    2.1.7 分子鉴定及系统发育分析  24
    2.1.8 耐铝酵母菌株生长曲线的测定  24
    2.1.9 耐铝能力检测  24
  2.2 结果  24-39
    2.2.1 菌体形态  24-25
    2.2.3 ITS和26S rDNA的D1/D2区序列扩增  25-27
    2.2.4 测序结果  27-31
    2.2.5 构建系统进化树  31-36
    2.2.6 酵母菌株生长曲线的测定  36-38
    2.2.7 酵母耐铝性能检测  38-39
  2.3 讨论  39-40
第三章 铝胁迫下土生隐球酵母生理分析  40-56
  3.1 实验材料与方法  40-45
    3.1.1 铝胁迫下酵母细胞的流式分析  40
    3.1.2 FDA-PI双染色观察铝胁迫下土生隐球酵母的细胞凋亡  40-41
    3.1.3 培养过后培养液中活性铝含量测定  41
    3.1.4 总蛋白含量测定  41-42
    3.1.5 铝胁迫下酵母PC含量的测定  42
    3.1.6 SOD活性的测定  42-43
    3.1.7 可溶性糖含量的测定  43-44
    3.1.8 丙二醛含量的测定  44-45
  3.2 结果  45-54
    3.2.1 铝胁迫下酵母细胞的流式分析  45-49
    3.2.2 FDA-PI双染色观察铝胁迫下土生隐球酵母  49
    3.2.3 培养基中剩余活性铝含量的测定  49-50
    3.2.4 总蛋白含量的测定  50-51
    3.2.5 PC含量的测定  51-52
    3.2.6 SOD酶活性的测定  52
    3.2.7 可溶性糖含量的测定  52-53
    3.2.8 丙二醛含量的测定  53-54
  3.3 讨论  54-56
第四章 土生隐球酵母铝胁迫响应基因的鉴定  56-83
  4.1 材料和方法  56-66
    4.1.1 酵母的铝胁迫处理  56
    4.1.2 隐球酵母总RNA的提取和纯化  56-57
    4.1.3 分光光度法检测RNA浓度  57
    4.1.4 mRNA的分离  57-58
    4.1.5 土生隐球酵母SSH文库的构建  58-64
    4.1.6 SSH文库克隆插入片段长度的检测  64-65
    4.1.7 SSH文库克隆测序分析  65
    4.1.8 RT-PCR分析  65-66
  4.2 结果  66-79
    4.2.1 土生隐球酵母RNA的提取与质量分析  66-67
    4.2.2 mRNA的分离  67-68
    4.2.3 cDNA合成与Rsa Ⅰ酶切  68-69
    4.2.4 消减杂交和抑制PCR  69-71
    4.2.5 PCR鉴定插入片段  71
    4.2.6 阳性克隆的序列测定及其同源性分析  71-77
    4.2.7 表达谱分析  77-79
  4.3 讨论  79-83
    4.3.1 细胞结构相关基因  80
    4.3.2 能量和代谢相关基因  80-81
    4.3.3 防御胁迫相关基因  81
    4.3.4 信号转导相关基因  81-83
第五章 总结  83-85
致谢  85-86
参考文献  86-95
附录A 攻读硕士期间发表论文  95

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