学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
耐铝酵母菌的分离及土生隐球酵母铝响应基因的鉴定
作 者: 王阁奇
导 师: 陈丽梅
学 校: 昆明理工大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茶园酸性土壤 铝 土生隐球酵母 SSH文库
分类号: S154.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 7次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
铝在酸性土壤中主要以对生物有毒的A13+形式存在,因此,铝毒害是酸性土壤中影响农作物产量最主要的毒害因子之一。研究生物耐铝机理是解决酸性土壤上铝毒害问题的基础。微生物生长快,周期短,是研究耐铝机理比较好的模式材料。分离具有较高耐铝能力的微生物,鉴定铝胁迫响应基因,研究微生物的耐铝机理,可以为改良铝敏感作物提供基因资源,为植物耐铝机制的研究提供参考。因此本研究通过分离耐铝能力较强的菌株,并利用抑制消减杂交技术鉴定土生隐球酵母铝胁迫响应基因,探讨耐铝毒的分子机理。主要研究结果如下:采集云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤,在pH3.5条件下,含20mmol.L-1 Al3+的GM固体培养基上分离获得4株耐铝菌株,分别命名为1-1,1-28,3-4,3-13。通过形态观察及基于真菌ITS和26S rDNA D1/D2基因分子进化系统分析,初步鉴定:1-1菌株可能为Cryptococcus humicola,1-28菌株可能为Cryptococcus rajasthanensis,3-4菌株可能为Cryptococcus laurentii,3-13菌株可能为Rhodotorula mucilaginosa。将测序所得的ITS和26S rDNA D1/D2基因序列提交到GenBank数据库,获得相应的Accession numbers, ITS分别为:HM459599 (1-1), HM459601 (1-28), HM469461 (3-4), HM469463 (3-13); 26S rDNA D1/D2分别为:HM459598 (1-1), HM459600 (1-28), HM469460 (3-4), HM469462 (3-13).对4株菌株进行耐铝能力分析,得到如下结果:在GM液体培养基中,1-1可以在含200mmol.L-1 Al3+的培养基中生长,1-28,3-4,3-13均可在100mmol.L-1Al3+的培养基中生长。在GM固体培养基中,4株菌均可在含150mmol.L-1 Al3+的培养基上生长,其中,1-1,1-28在含200mmol.L-1 Al3+的培养基上仍能生长,但生长速度受到明显抑制。通过流式细胞仪分析了在0、20、50、100、200mmol.L-1 Al3+条件下,土生隐球酵母的凋亡情况。随着铝浓度的增加,凋亡细胞明显增多;在100mmol.L-1时出现明显的凋亡峰;高浓度下细胞受到毒害加深,细胞有变小趋势。在含20mmol.L-1铝的培养基中培养48h后剩余的铝含量在98%以上,说明吸收和吸附并不是土生隐球酵母耐铝机理的主要机制。测定了隐球酵母在20 mmol.L-1铝胁迫下的生理指标。随着培养时间的增长,总蛋白含量恒定;PC含量呈现显著下降趋势;SOD活性总体先下降后上升;可溶性糖含量先下降随后又恢复正常;丙二醛含量呈上升趋势。利用抑制消减杂交技术构建土生隐球酵母20mmol.L-1铝胁迫下的正向SSH cDNA文库,挑选1200个阳性克隆组成文库。PCR检测发现文库插入片段主要分布在0.2~0.8 kp之间。从SSH cDNA文库中选出插入片段大于200bp的克隆进行测序,测序结果分析后获得了252条EST序列,剔除重复序列后获得141条差异EST序列。己知功能的EST序列占46%,其中6%与能量相关,代谢相关的有16%,与胁迫防御相关的有1%,与蛋白合成和加工相关的占16%,参与信号转导的为3%,细胞骨架相关的为6%;功能未知的EST序列占19%;获得的新EST序列占35%。通过RT-PCR分析验证文库中14个基因的表达水平,结果表明:ATP:ADP反向转运体,△12脂肪酸去饱和酶,果糖二磷酸醛缩酶,Rhol GTP酶,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,液泡蛋白基因在铝胁迫下呈不同程度的上调表达。
|
全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-11 插图和附表清单 11-13 缩略词 13-14 第一章 文献综述 14-22 1.1 研究背景 14 1.2 耐铝微生物的分离 14-16 1.3 微生物的耐铝机制的研究进展 16-21 1.3.1 酵母耐铝机制的研究进展 16-17 1.3.2 假单胞菌耐铝机制 17-19 1.3.3 菌根真菌的耐铝机制 19-20 1.3.4 其它微生物耐铝机制 20 1.3.5 小结 20-21 1.4 研究目的和意义 21-22 第二章 耐铝微生物的分离纯化及其鉴定 22-40 2.1 材料与方法 22-24 2.1.1 土壤样品的采集 22 2.1.2 培养基的配制 22 2.1.3 菌株分离纯化 22-23 2.1.4 菌落及菌体形态观察 23 2.1.5 酵母基因组DNA的提取 23 2.1.6 ITS和26S rDNAD1/D2片段的PCR扩增 23-24 2.1.7 分子鉴定及系统发育分析 24 2.1.8 耐铝酵母菌株生长曲线的测定 24 2.1.9 耐铝能力检测 24 2.2 结果 24-39 2.2.1 菌体形态 24-25 2.2.3 ITS和26S rDNA的D1/D2区序列扩增 25-27 2.2.4 测序结果 27-31 2.2.5 构建系统进化树 31-36 2.2.6 酵母菌株生长曲线的测定 36-38 2.2.7 酵母耐铝性能检测 38-39 2.3 讨论 39-40 第三章 铝胁迫下土生隐球酵母生理分析 40-56 3.1 实验材料与方法 40-45 3.1.1 铝胁迫下酵母细胞的流式分析 40 3.1.2 FDA-PI双染色观察铝胁迫下土生隐球酵母的细胞凋亡 40-41 3.1.3 培养过后培养液中活性铝含量测定 41 3.1.4 总蛋白含量测定 41-42 3.1.5 铝胁迫下酵母PC含量的测定 42 3.1.6 SOD活性的测定 42-43 3.1.7 可溶性糖含量的测定 43-44 3.1.8 丙二醛含量的测定 44-45 3.2 结果 45-54 3.2.1 铝胁迫下酵母细胞的流式分析 45-49 3.2.2 FDA-PI双染色观察铝胁迫下土生隐球酵母 49 3.2.3 培养基中剩余活性铝含量的测定 49-50 3.2.4 总蛋白含量的测定 50-51 3.2.5 PC含量的测定 51-52 3.2.6 SOD酶活性的测定 52 3.2.7 可溶性糖含量的测定 52-53 3.2.8 丙二醛含量的测定 53-54 3.3 讨论 54-56 第四章 土生隐球酵母铝胁迫响应基因的鉴定 56-83 4.1 材料和方法 56-66 4.1.1 酵母的铝胁迫处理 56 4.1.2 隐球酵母总RNA的提取和纯化 56-57 4.1.3 分光光度法检测RNA浓度 57 4.1.4 mRNA的分离 57-58 4.1.5 土生隐球酵母SSH文库的构建 58-64 4.1.6 SSH文库克隆插入片段长度的检测 64-65 4.1.7 SSH文库克隆测序分析 65 4.1.8 RT-PCR分析 65-66 4.2 结果 66-79 4.2.1 土生隐球酵母RNA的提取与质量分析 66-67 4.2.2 mRNA的分离 67-68 4.2.3 cDNA合成与Rsa Ⅰ酶切 68-69 4.2.4 消减杂交和抑制PCR 69-71 4.2.5 PCR鉴定插入片段 71 4.2.6 阳性克隆的序列测定及其同源性分析 71-77 4.2.7 表达谱分析 77-79 4.3 讨论 79-83 4.3.1 细胞结构相关基因 80 4.3.2 能量和代谢相关基因 80-81 4.3.3 防御胁迫相关基因 81 4.3.4 信号转导相关基因 81-83 第五章 总结 83-85 致谢 85-86 参考文献 86-95 附录A 攻读硕士期间发表论文 95
|
相似论文
- 铝阳极在NaCl溶液中的缓蚀剂的研究,TG174.42
- 筒形件可控径向加压充液拉深数值模拟与实验研究,TG386
- 铝胁迫下小黑豆的红外光谱特征分析及其铝胁迫响应基因的鉴定,S529
- 工程陶瓷的激光热裂法切割技术研究,TQ174.62
- 凝胶—发泡法制备多孔氧化铝隔热材料的研究,TQ174.1
- 铝铵基阳离子淀粉的制备及其在造纸中的应用,TS727
- 废弃氟石膏改性利用及高含氟废水处理研究,X703
- 耐铝毒水稻(Oryza sativa L.)种质资源的筛选及不同形态N素对水稻幼苗耐铝性的影响,S511
- 基于TWC脱除垃圾焚烧烟气中NOx实验研究,O643.36
- 反应烧结多孔钛酸铝材料的研究,TQ133.1
- 膨松剂在食品中应用的调查与研究分析,TS202.3
- 二维晶格失配外延铝薄膜结构弛豫的分子动力学模拟,O484.1
- 隔热保温多孔陶瓷材料性能研究,TQ174.1
- 汽车天窗骨架钢—铝合金机械变形压力连接过程仿真分析,U463.83
- 双取代负热膨胀材料Zr1-xAlxMoW1-yVyO8及其复合材料的研究,TB34
- 稀土铝酸盐Dy3Al5O12、NdAlO3、LaAl11O18粉体制备及烧结行为研究,TB383.3
- 超分散剂的制备及其结构对不饱和树脂/氢氧化铝体系的影响,TB324
- 环缝可调风帽型流化床CFD数值模拟与验证实验,TQ051
- 铝合金压铸用水基乳液涂料的开发研究,TQ630.7
- Co3O4/Al2O3纳米材料的合成、表征及对罗丹明B的催化降解作用,TB383.1
- 功率框架铝丝键合失效与AOI检查,TG441
中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 土壤学 > 土壤生物学 > 土壤微生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com
|