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棉铃虫氨肽酶N(Haapnl)和钙粘蛋白(Ha_BtR)基因的RNA干扰及对CrylAc毒力的影响
作 者: 周慧丹
导 师: 吴益东
学 校: 南京农业大学
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 棉铃虫 氨肽酶N 钙粘蛋白 RNA干扰 定量PCR
分类号: S435.622.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)是一种重要的世界性棉花害虫。自转Bt基因棉花大面积种植以来,棉铃虫得到了有效的控制,并且减少了化学农药的使用。在Bt棉花长期选择压力下,棉铃虫对Bt棉花的抗性风险问题不容回避。棉铃虫氨肽酶N (Haapn1)和钙粘蛋白(Ha_BtR)是Bt毒素Cry1Ac作用过程中的两个重要受体,Haapn1以及Ha BtR基因突变都能使棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。本文将Haapn1和Ha_BtR基因的一段双链RNA注射到棉铃虫四龄幼虫体内,测定单个基因或两个基因沉默后对Cry1Ac活化毒素和原毒素毒力的影响,以期探明棉铃虫Haapn1和Ha_BtR这两个受体在Bt毒素Cry1Ac毒杀过程中的相互作用,有助于对Bt毒素作用机理和抗性机理进行更全面的认识。1.氨肽酶N(Haapn1)和钙粘蛋白(Ha_BtR) dsRNA;主射剂量的确定通过RT-PCR扩增出Haapn1和Ha_BtR基因片段,并以此作为模板合成dsRNA。用微量进样器将双链RNA导入到4龄幼虫淋巴液中,分别注射Haapn1、Ha_BtR dsRNA 1μg、3μg、6μg和12μg,注射ES缓冲液(elution solution)作为对照。48小时后实时荧光定量PCR检测结果表明,注射1μg Haapn1 dsRNA后,mRNA表达量下降为对照的49%;注射1μg Ha_BtR dsRNA后,表达量下降为对照的70%。注射1μg dsRNA剂量的基因沉默效率高于其他剂量,因此确定1μg dsRNA为本研究采用的注射剂量。2. Haapn1和Ha_BtR单个基因被干扰后对Cry1Ac毒力的影响在棉铃虫敏感品系(SCD)中,Cry1Ac活化毒素对注射Haapn1 dsRNA幼虫的毒力显著低于对注射ES幼虫的毒力;而Cry1Ac原毒素对注射Haapn1 dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力无显著差异。Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。在敏感品系SCD与钙粘蛋白突变品系SCD-r1杂交后代(F1)中分别沉默Haapn1和Ha_BtR基因,以研究在Haa_BtR低表达的条件下其对Cry1Ac毒力的影响。Cry1Ac活化毒素对注射Haapn1 dsRNA幼虫的死亡率低于注射ES幼虫的死亡率(差异极显著),而原毒素对注射Haapn1 dsRNA和ES的幼虫的毒力无显著差异。注射Ha_BtR dsRNA幼虫对Cry1Ac活化毒素(在第四天和第五天)及原毒素(在第三天和第四天)的敏感性显著低于注射ES的幼虫。3. Haapn1和Ha_BtR两个基因同时被干扰后对Cry1Ac毒力的影响在SCD品系幼虫中注射Haapn1和Ha_BtR dsRNA混合液(各1μg)后,Haapn1 mRNA和Ha_BtR mRNA表达量分别下降为对照的54%和63%。干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降,在第五天的差异达到极显著。在F1幼虫中注射Haapn1和Ha_BtR dsRNA混合液(各1μg)后,两个基因的表达量分别下降为对照的67%和36%。Cry1Ac活化毒素对干扰后的幼虫的毒力(在第4天和第5天)低于对注射ES幼虫的毒力(差异极显著);Cry1Ac原毒素对干扰后幼虫的死亡率也低于对照组的死亡率(在第5天差异极显著)。因此,棉铃虫幼虫Haapn1表达量下降能够使Cry1Ac毒力显著下降,Ha_BtR表达量下降对Cry1Ac毒力的影响有限;与单个基因被dsRNA沉默相比,Haapn1和Ha_BtR同时被dsRNA沉默对Cry1Ac毒力的影响更大。上述研究表明,棉铃虫Haapn1和Ha_BtR作为Cry1Ac的功能受体共同参与Cry1Ac的毒杀作用,其中的任何一个基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。
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全文目录
摘要 6-8 ABSTRACT 8-11 第一章 文献综述 11-31 1 Bt毒素 11-13 1.1 苏云金芽孢杆菌 11 1.2 Bt毒素命名和分类 11-12 1.3 Bt毒素的应用 12-13 2 昆虫对Bt毒素的抗性研究概况 13-26 2.1 Bt毒素的作用机理 13-15 2.2 Bt毒素在昆虫中肠内的结合受体 15-20 2.2.1 受体氨肽酶N 15-17 2.2.2 类钙粘蛋白受体 17-19 2.2.3 其他类受体 19-20 2.3 昆虫对Bt毒素的抗性现状 20-21 2.4 Bt毒素抗性机理研究进展 21-25 2.4.1 昆虫中肠蛋白酶的改变 21-22 2.4.2 APN类受体的改变 22-23 2.4.3 Cadherin类受体的改变 23-24 2.4.4 其他类受体的改变 24-25 2.5 Bt抗性治理策略 25-26 3 RNA干扰技术以及研究进展 26-31 3.1 RNA干扰的发现 26-27 3.2 RNAi的作用机制 27 3.2.1 Dicer降解dsRNA成为siRNA 27 3.2.2 RISC参与的特异性mRNA的降解 27 3.2.3 通过RdRP进行RNAi过程中的循环放大机制 27 3.3 RNAi的系统性及其机理 27-28 3.4 RNAi在昆虫中的应用 28-31 3.4.1 昆虫RNAi的方法 29-30 3.4.2 RNAi技术在昆虫中的应用现状 30-31 第二章 RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N(Haapn1)和钙粘蛋白(Ha_BtR)基因沉默对Cry1Ac毒力影响 31-65 1 材料与方法 33-38 1.1 供试昆虫 33 1.2 主要试剂和仪器设备 33 1.2.1 主要试剂 33 1.2.2 主要仪器设备 33 1.3 供试棉铃虫的饲养 33-34 1.4 昆虫中肠总RNA提取以及cDNA第一链的合成 34 1.5 Haapn1和Ha_BtR基因片段的克隆 34-36 1.6 双链RNA的合成 36 1.7 试虫dsRNA的注射 36 1.8 Haapn1和Ha_BtR dsRNA的注射 36 1.9 RNAi基因沉默效率检测 36-38 1.10 生物测定 38 1.10.1 敏感幼虫SCD四龄幼虫生测 38 1.10.2 注射dsRNA后四龄幼虫的生测 38 1.11 数据分析与统计 38 2 结果与分析 38-62 2.1 棉铃虫Haapn1和Ha_BtR基因片段的扩增、克隆与序列分析 38-41 2.2 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析 41-44 2.3 Haapn1和Ha_BtR dsRNA注射剂量的确定 44-46 2.4 Cry1Ac活化毒素和原毒素对棉铃虫的毒力测定 46 2.5 在敏感品系SCD中Haapn1和Ha_BtR基因沉默对Cry1Ac毒力影响 46-54 2.5.1 Haapn1基因沉默对Cry1Ac毒力影响 46-48 2.5.2 Ha_BtR基因沉默对Cry1Ac毒力影响 48-51 2.5.3 Haapn1和Ha_BtR同时沉默对Cry1Ac毒力的影响 51-54 2.6 SCD与SCD-r1杂交后代(F_1)Ha_BtR mRNA相对表达量 54 2.7 在F_1中Haapn1和Ha_BtR基因沉默对Cry1Ac毒力影响 54-62 2.7.1 在F_1中Haapn1基因沉默对Cry1Ac毒力影响 54-56 2.7.2 在F_1中Ha_BtR基因沉默对Cry1Ac毒力影响 56-59 2.7.3 在F_1中Haapn1和Ha_BtR同时沉默对Cry1Ac毒力的影响 59-62 3 讨论 62-65 全文总结 65-67 参考文献 67-79 附表1 79-81 致谢 81
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 纤维作物病虫害 > 棉病虫害 > 虫害 > 棉红铃虫
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