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不同共代谢基质调节Stenotrophomonas maltophilia R551-3的吡虫啉代谢途径的研究

作　者: 张文健
导　师: 戴亦军
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 吡虫啉 Stenotrophomonas maltophilia R551-3 共代谢基质 羟基化 硝基还原
分类号: S482.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMI)的土壤和动植物代谢被广泛的研究和报道,但目前尚未见其代谢途径的调控报道。本文选择全基因组序列已公布的Stenotrophomonas maltophilia R551-3菌株为研究对象,研究不同共代谢基质控制的IMI代谢途径及其调节机制。本文首先采用化学合成方法制备IMI (=N-NO2)的衍生物guanidine IMI (=NH), nitrosoIMI (=N-NO), urea IMI(=O),用微生物转化方法制备出5-hydroxy IMI和olefin IMI,这些IMI衍生物用于HPLC定量分析。以蔗糖为共代谢基质,S. maltophilia R551-3能够转化IMI生成主要代谢产物5-hydroxy IMI以及少量自发水解产物olefin IMI。与对照组相比,以蔗糖为共代谢基质IMI的羟基化作用增强8倍,硝基还原途径却被完全抑制。以琥珀酸钠为共代谢基质,则同时产生5-hydroxy, olefin和area IMI代谢产物以及一个未知产物(保留时间3.1 mmin),说明以琥珀酸为共代谢基质,S.maltophilia R551-3同时产生IMI羟基化和硝基还原两条途径。以蔗糖和琥珀酸钠为共代谢基质,第8d时IMI分别降解了23.1%和57.6%,琥珀酸比蔗糖更能促进IMI的降解。以5-hydroxy IMI为转化底物和琥珀酸钠为共代谢基质,5. maltophilia R551-3可将5-hydroxy IMI转化成olefin IMI,而以蔗糖为共代谢基质,5-hydroxy IMI则不能被转化。以Nitroso IMI为底物和以琥珀酸钠为共代谢基质,S. maltophilia R551-3可将nitroso IMI转化为urea IMI和和guanidine IM。以琥珀酸钠或蔗糖为共代谢基质,guanidine IMI和urea IMI都不能被S. maltophilia R551-3转化,表明urea IMI是IMI代谢的终产物且其生成不是经由guanidine IMI途径。HMP途径抑制剂6-氨基烟酰胺的抑制了61.8%的IMI降解和60%的5-hydroxy IMI生成,这表明在S. maltophilia R551-3羟基化IMI过程中磷酸五糖(HMP)途径是蔗糖的主要代谢途径。丙酮酸钠和苹果酸钠能促进olefin IMI的生成,但并不抑制area IMI的生成。添加乙酸钠能部分解除蔗糖对IMI被硝基还原成urea IMI的抑制作用。NADPH抑制了22.2%的ureaIMI生成而NADH不抑制。上述结果表明蔗糖经过HMP途径产生的NADPH能够抑制IMI的硝基还原途径。通过上述研究,本论文认为不同共代谢基质控制IMI代谢途径的机制与共代谢基质蔗糖和琥珀酸钠的胞内代谢流有关：若初级能源物质经由HMP途径代谢,其代谢过程中产生辅因子为NADPH, NADPH被用于IMI的羟基化,同时NADPH抑制IMI的硝基还原和5-hydroxy IMI脱水生成olefinIMI。若初级能源物质经由EMP途径或TCA循环,则不抑制IMI的硝基还原和5-hydroxy IMI的脱水生成olefin IMI。本文进一步比较了S.maltophilia R551-3与CGMCC 1.1788的IMI共代谢差异。以琥珀酸为初级能源物质,S. maltophilia CGMCC 1.1788和R551-3静息细胞(非生长细胞)的IMI硝基还原途径(urea IMI的生成)差异不大。S. maltophilia CGMCC 1.1788的静息细胞的IMI降解能力比R551-3高出近一倍,olefin IMI的合成能力是R551-3的8.3倍；S. maltophilia CGMCC 1.1788的细胞粗提液丧失了olefin IMI合成能力,而R551-3菌株细胞提取液却保持了olefin IMI的合成能力。以蔗糖为初级能源物质,S. maltophilia CGMCC 1.1788静息细胞的IMI羟基化能力是R551-3的5.6倍；S. maltophilia CGMCC1.1788细胞粗提液的IMI羟基化能力急剧下降,而R551-3的细胞提取液的IMI羟基化能力与完整细胞几乎相当。以琥珀酸作为碳源,S. maltophilia CGMCC 1.1.788生长细胞的IMI降解能力要远高于S. maltophilia R551-3;以蔗糖为碳源,S. maltophilia CGMCC 1.1788的生长细胞的IMI羟基化能力比S. maltophilia R551-3高。上述研究表明S.maltophilia R551-3与CGMCC 1.1788菌株间存在巨大的IMI共代谢差异。

全文目录


目录  3-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
缩写  11-12
第一章 前言  12-19
  一、烟碱类农药概述  12-13
  二、共代谢作用研究  13-14
  三、IMI代谢研究  14-17
  四、本文的研究思路  17-19
第二章 IMI衍生物的化学和生物合成  19-35
  1. 材料与方法  19-23
    1.1 菌种  19
    1.2 培养基  19
    1.3 试剂与仪器  19-20
    1.4 guanidine IMI的化学方法合成  20
    1.5 nitroso IMI的化学方法合成  20
    1.6 urea IMI的化学方法合成  20-21
    1.7 微生物转化方法制备5-hydroxy IMI  21-22
      1.7.1 发酵罐培养和转化方法  21
      1.7.2 转化产物提取与提纯  21-22
    1.8 olefin IMI的化学方法合成  22
    1.9 HPLC分析  22
    1.10 MS分析  22
    1.11 核磁共振光谱分析  22
    1.12 标准溶液的配制  22-23
  2. 结果  23-33
    2.1 guanidine IMI的化学方法制备并鉴定  23-24
    2.2 nitroso IMI的化学方法制备与鉴定  24-26
    2.3 urea IMI的化学方法制备与鉴定  26-28
    2.4 5-hydroxy IMI的微生物转化方法制备与鉴定  28-30
    2.5 olefin IMI的化学方法制备与鉴定  30-31
    2.6 标准校正曲线的线性回归方程  31-33
  3. 讨论  33-34
  本章小结  34-35
第三章 S.maltophilia R551-3共代谢IMI途径研究  35-51
  1. 材料和方法  35-39
    1.1 菌种  35
    1.2 培养基  35-36
    1.3 试剂和仪器  36
    1.4 培养和转化方法  36
    1.5 5-hydroxy IMI转化产物的制各  36-37
    1.6 nitroso IMI转化产物的提取与纯化  37-38
      1.6.1 转化体积的扩大  37
      1.6.2 有机溶剂萃取和浓缩  37
      1.6.3 TLC分离产物  37
      1.6.4 结晶  37-38
    1.7 亚硝酸根离子的测定  38
    1.8 PH对S.maltophilia R551-3代谢IMI,5-hydroxy IMI和nitro IMI的影响  38
    1.9 HPLC分析  38
    1.10 MS分析  38
    1.11 核磁共振光谱分析  38-39
  2. 结果  39-48
    2.1 Smaltophilia R551-3以琥珀酸钠和蔗糖为共代谢基质对IMI的代谢研究  39-42
    2.2 Smaltophilia R551-3以琥珀酸钠和蔗糖为共代谢基质对5-hydroxy IMI的代谢研究  42-44
    2.3 Smaltophilia R551-3以琥珀酸钠为共代谢基质对nitroso IMI的代谢研究  44-47
    2.4 S.maltophilia R551-3以琥珀酸钠为共代谢基质对guanidine和urea IMI的代谢研究  47-48
    2.5 pH对IMI及其衍生物的转化的影响  48
  3. 讨论  48-49
  本章小结  49-51
第四章 不同共代谢基质调节S.maltophilia R551-3的IMI代谢途径的机制研究  51-57
  1. 材料和方法  51-53
    1.1 菌种  51
    1.2 培养基  51
    1.3 试剂和仪器  51-52
    1.4 培养和转化方法  52-53
      1.4.1 静息细胞转化  52
      1.4.2 细胞提取液转化  52-53
    1.5 HPLC分析  53
  2. 结果  53-55
    2.1 6-氨基烟酰胺和乙酸钠对IMI代谢的影响  53-54
    2.2 丙酮酸钠和苹果酸钠对IMI代谢的影响  54
    2.3 NADH和NADPH对IMI代谢的影响  54-55
  3. 讨论  55-56
  本章小结  56-57
第五章 S.maltophilia R551-3与S.maltophilia CGMCC 1.1788的共代谢IMI的差异研究  57-63
  1. 材料和方法  57-59
    1.1 菌种  57
    1.2 培养基  57-58
    1.3 试剂和仪器  58
    1.4 培养和转化方法  58
      1.4.1 静息转化和细胞提取液转化  58
      1.4.2 生长转化  58
    1.5 HPLC分析  58-59
  2. 结果  59-61
    2.1 Smaltophilia R551-3与Smaltophilia CGMCC 1.1788静息细胞和细胞提取液转化IMI的比较  59-60
    2.2 Smaltophilia R551-3与Smaltophilia CGMCC 1.1788生长转化IMI的比较  60-61
  3. 讨论  61-62
  本章小结  62-63
参考文献  63-68
论文创新和不足之处  68-70
致谢  70-71
附件  71
  在读硕士期间主要科研情况  71

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 杀虫剂
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