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马氏珠母贝精子质量检测方法的研究

作　者: 豆伟
导　师: 余祥勇
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 马氏珠母贝精子存活率质膜完整性 DNA完整性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文选用台盼蓝及荧光染料对马氏珠母贝(Pinctada martensii)精液进行染色,通过显微镜观察比较染色效果,筛选出适宜马氏珠母贝精子质量检测的染色方法,使之应用于其精子质量评价中所需的精子活率、质膜完整性和DNA完整性等指标的检测中,也为贝类精子的质量检测提供最基础的参考数据。1、台盼蓝染色法检测马氏珠母贝活精率的研究本文采用台盼蓝染色法对马氏珠母贝活精率进行了检测。结果显示,经台盼蓝染色后,在显微镜下可以明显区分死活精子。活精子不着色,呈透明状;死精子变大着蓝色。通过对该染料不同的染色浓度和染色时间的比较得出,台盼蓝最适的染色浓度为0.2 %(终浓度)、染色时间为15 min。配制含有不同死亡率的9个样品(10~90 %)作为理论死亡率,用0.2 %的台盼蓝和0.04 %曙红Y(终浓度)同时检测上述各样品。结果显示,两种染料检测得出实际死亡率与理论死亡率呈极显著正相关(P<0.01),同时两种染色方法的结果之间亦呈极显著正相关(P<0.01)。用台盼蓝和曙红Y检测了染料对精子的毒性作用以及室温(28℃)放置下精子的自然死亡率。结果显示,当达到一定时间积累后,两种染料对精子都有一定的毒性作用,但是在45 min之内,毒性作用不明显。上述各实验结果表明,用0.2 %的台盼蓝染色15 min可准确、可靠的检测马氏珠母贝精子的存活率,能较真实的反映精子的状态。2、二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate, FDA)-碘化丙锭(Propidium iodide, PI)双荧光复染法检测马氏珠母贝精子活精率的研究本文通过两种荧光染料FDA和PI的联用在荧光显微镜下检测马氏珠母贝精子的活率。通过不同的染色浓度和染色时间的比较发现,FDA和PI的最适染色浓度均为10 ug/mL,染色时间控制在10 min之内为宜。用新鲜精液和水浴致死的精液配制含有不同死亡率的5个样品(0 %、20 %、40 %、60 %和80 %),作为理论死亡率,用FDA和PI测定各样品精子的死亡率,并进行相关性分析。结果显示,荧光探针FDA和PI能分别标记活精子和死精子,活精子发出绿色荧光,死精子发出红色荧光。各样品实测精子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关(P<0.01)。且染料FDA和PI加入精液的顺序对精子存活率的检测结果没有影响(P>0.05);表明FDA-PI双荧光复染法是一种灵敏度高、重复性好、准确有效的检测马氏珠母贝精子存活率的实验室方法。用FDA和PI检测了超低温冷冻前后精子的活精率。结果显示,精液经超低温冷冻后精子的存活率明显降低(P<0.01),质膜受到不同程度的损伤。同时探讨了不同的冷冻保存体积对马氏珠母贝精子存活率的影响,结果显示,体积过大或过小都会影响精子的存活率,冷冻时最佳的保存体积为1.2-1.6 mL。3、吖啶橙(Acridine Orange, AO)染色法检测马氏珠母贝精子DNA的完整性本文用AO染色来检测马氏珠母贝精子DNA的完整性。结果显示,精液经AO染色后,在荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光、红色荧光或橘黄色荧光的精子,其中发绿色荧光的精子DNA双链结构完整,发红色或橘黄色荧光的精子DNA双链已受到不同程度的损伤,DNA双链结构已断裂为单链。通过不同染色浓度和时间的比较发现,最适的AO染色浓度为200 ug/mL,染色时间为5 min。在此基础上,用AO染色法检测评价超低温冷冻前后精子DNA的完整性。结果显示,冷冻对精子的DNA双链结构会有不同程度的损伤。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
1 引言  12-23
  1.1 精子质膜完整性的检测  12-15
    1.1.1 常规染色法  12-13
    1.1.2 荧光染色技术  13-14
    1.1.3 低渗肿胀试验  14-15
  1.2 精子DNA 完整性的检测  15-19
    1.2.1 精子染色质的形成及其作用  15-16
    1.2.2 精子DNA 损伤的机制  16-17
    1.2.3 常用的检测精子DNA 完整性的方法  17-19
  1.3 马氏珠母贝研究概况  19-20
  1.4 本文研究意义及研究内容  20-23
    1.4.1 研究意义  20-21
    1.4.2 研究内容  21-23
2 台盼蓝染色法检测马氏珠母贝活精率的研究  23-30
  2.1 材料与方法  23-24
    2.1.1 精子的处理  23
    2.1.2 染液的配制和浓度设定及精子染色特征的判断  23
    2.1.3 不同染色浓度和染色时间下精子死亡率的比较  23
    2.1.4 不同染料毒性的检测  23-24
    2.1.5 精子自然死亡率的检测  24
    2.1.6 两种染色方法的相关性比较  24
    2.1.7 数据分析  24
  2.2 结果与分析  24-27
    2.2.1 精子的染色特征  24-25
    2.2.2 不同染色浓度和染色时间下精子死亡率的比较  25
    2.2.3 理论死亡率和实测死亡率的相关性比较  25-26
    2.2.4 台盼蓝和曙红Y 染液对精子毒性的检测及室温下台盼蓝对精子自然死亡率的检测  26-27
  2.3 讨论  27-30
    2.3.1 台盼蓝染色法  27-28
    2.3.2 两种染料对精子的毒性作用及新鲜精液的自然死亡率  28
    2.3.3 展望  28-30
3 双荧光复染法检测马氏珠母贝活精率的研究  30-40
  3.1 材料与方法  30-31
    3.1.1 精子的获得及样品的制备  30
    3.1.2 实验试剂及仪器  30
    3.1.3 不同染料浓度和染色时间下精子死亡率的比较  30-31
    3.1.4 双荧光复染法检测理论死亡率和实测死亡率的相关性  31
    3.1.5 不同的FDA 和PI 加入顺序对精子死亡率的影响  31
    3.1.6 双荧光复染法检测冷冻前后精子的死亡率  31
    3.1.7 不同冷冻保存体积对精子死亡率的影响  31
    3.1.8 统计学分析  31
  3.2 结果与分析  31-36
    3.2.1 FDA 和PI 的荧光染色结果观察  31-32
    3.2.2 FDA 和PI 最佳染色浓度及时间的确定  32-33
    3.2.3 理论死亡率和实测死亡率相关性比较  33
    3.2.4 精液中FDA 和PI 的加入顺序对精子死亡率的影响  33-34
    3.2.5 双荧光复染法检测冷冻前后精子的死亡率  34-35
    3.2.6 冷冻样品不同保存体积对精子死亡率的影响  35-36
  3.3 讨论  36-40
    3.3.1 FDA 和PI 荧光染色  36-37
    3.3.2 FDA 和PI 不同加入顺序对染色效果的影响  37
    3.3.3 最适染色浓度和时间的确定及相关性分析  37-38
    3.3.4 冷冻对精子死亡率和质膜完整性的影响  38
    3.3.5 冷冻样品体积对精子死亡率的影响  38-40
4 吖啶橙染色法检测马氏珠母贝精子DNA 的完整性  40-45
  4.1 材料与方法  40-41
    4.1.1 精子的获得及样品的制备  40
    4.1.2 实验试剂及仪器  40
    4.1.3 不同染料浓度和染色时间下精子DNA 完整率的比较  40
    4.1.4 吖啶橙荧光染色法检测冷冻前后精子的DNA 完整性  40
    4.1.5 统计学分析  40-41
  4.2 结果与分析  41-42
    4.2.1 AO 荧光染色结果观察  41
    4.2.2 AO 最佳染色浓度及染色时间的确定  41-42
    4.2.3 冷冻前后精子DNA 完整率的比较  42
  4.3 讨论  42-45
    4.3.1 精子DNA 完整性的检测  42-43
    4.3.2 AO 最适浓度的确定  43
    4.3.3 冷冻对精子DNA 完整性的影响  43-45
5 结论  45-46
参考文献  46-54
致谢  54-55
作者简介  55-56
导师简介  56

马氏珠母贝精子质量检测方法的研究

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