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机械振动协同骨髓干细胞动员对大鼠闭合性骨折愈合血管生成的影响及其可能机制

作　者: 李磊
导　师: 田振军
学　校: 陕西师范大学
专　业: 运动人体科学
关键词: 闭合性骨折 机械振动 干细胞动员 血管再生
分类号: G804.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：探讨机械振动协同骨髓干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)动员对大鼠闭合性骨折愈合血管生成的影响及其可能机制。方法：清洁级3月龄Sprague-Dawley雌性大鼠160只,体重200±20g。随机分为4组,即骨折模型组(C组),骨折+动员剂组(M组),骨折+振动组(V组),骨折+动员剂+振动组(M+V组),每组40只。V组、M+V组骨折72h后接触30Hz累计15min/d,5d/W的间歇振动。M组和M+V组骨折3h后背部皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF,5μg/kg/d),共5d,各组分别在第1w/2w/4w/5w取材。免疫组化检测组织中CD31、CD34、VEGF、ANG-1和FⅧ-Rag蛋白表达,免疫印迹法分析愈合期骨组织中ANG-1和VEGF蛋白表达。实验结果：本实验采用大鼠骨折后rhG-CSF动员的方法来动员干细胞,促进BMSCs向骨外周血迁移,增加外周血的BMSCs,加速血管再生,改善局部血液供应促进骨折愈合。采用机械振动,加速局部血液循环,促进血管再生与重建,通过机械振动改善骨折周围力学环境,为骨折愈合提供合适的微环境。其结果如下：1用大鼠骨折造模支架造成大鼠股骨中段闭合性骨折,通过X光片判断,成功建立大鼠骨折模型。2机械振动和(或)rhG-CSF动员均可促进大鼠骨折愈合与功能恢复。但机械振动和rhG-CSF动员双重作用效果更为显著,优于骨折后单纯rhG-CSF动员作用或单纯机械振动作用。3机械振动和(或)rhG-CSF动员对大鼠骨折恢复过程中的血管再生及骨组织形成有一定促进作用。机械振动或rhG-CSF动员可使毛细血管数量增多,血管重建加速,较早地形成血管网；尤其以机械振动和机械振动协同rhG-CSF动员效果更明显。提示：骨折后进行机械振动协同rhG-CSF动员可促进骨折愈合早期的血管形成,改善骨折部位的微环境,促进骨折愈合。4机械振动和(或)rhG-CSF动员对大鼠骨折部位BMSCs动员显著。CD34+在各组实验大鼠骨折部位表达先升高后降低,第2周时是4次取材峰值,机械振动协同rhG-CSF动员组>机械振动组>rhG-CSF动员组>模型组。提示：机械振动协同rhG-CSF动员双重作用加强了BMSCs的动员,可趋化募集更多的BMSCs,加速骨折部位的损伤修复。5机械振动和(或)rhG-CSF动员可促进VEGF的表达,机械振动协同rhG-CSF动员的双重作用效果更加显著。VEGF在各组实验大鼠骨折部位表达先升高后降低,第2周时是4次取材峰值,机械振动协同rhG-CSF动员组>机械振动组>rhG-CSF动员组>模型组。6机械振动和(或)rhG-CSF动员均可促进Ang-1的表达,机械振动组、rhG-CSF动员组和模型组大鼠骨折部位表达规律为先升高后降低,第4周时是4次取材峰值,而机械振动和rhG-CSF动员双重作用组第2周时是4次取材的峰值,之后逐次下降,表现为机械振动协同rhG-CSF动员组>机械振动组>rhG-CSF动员组>模型组；机械振动和rhG-CSF动员双重作用刺激Ang-1表达最显著。7机械振动和(或)rhG-CSF动员均可促进FⅧ-Rag、CD31的表达,可反映大鼠骨折愈合过程中的血管新生。骨折愈合的血管再生高峰期在第2-4周,且机械振动协同rhG-CSF动员组>机械振动组>rhG-CSF动员组>模型组。提示,BMSCs动员和机械振动以及二者双重作用均可促进缺血组织血管生成,改善缺血区的血液灌注,加速骨折愈合。8血管生成素Ang-1的WB结果显示,正常情况下Ang-1表达量较少,骨折1周达高峰；动员剂组表达量呈逐渐升高,表达量多于安静组；振动组早期明显升高后呈自然下降规律,但表达量较多；动员振动组则从第2周到4周明显升高,5周时表达再次显著下降,但各期Ang-1表达量明显高于其他组。表明在骨折愈合期,机械振动和动员剂均可促进Ang-1表达,机械振动作用优于动员剂,早期二者合用促进血管生成效果显著。机械振动与动员剂合用效果更加显著,作用优于单一因素。9血管内皮生长因子VEGF的WB结果显示,正常情况下VEGF表达较少；动员剂组表达量逐渐升高,但表达量多于安静组；振动组早期明显升高后呈自然降低,但表达量较多；动员振动组表达量先降低后升高,但各期VEGF表达量明显高于其他组。表明在骨折愈合期,机械振动和动员剂均可促进VEGF表达,机械振动作用优于动员剂,在早期两者合用促进血管生成效果显著。机械振动与动员剂合用效果更加显著,作用优于单一因素。结论：机械振动和(或)rhG-CSF动员可显著增加大鼠骨折部位BMSCs标志物、血管再生因子、血管新生因子的表达,但机械振动和rhG-CSF动员双重作用效果更为显著。提示,机械振动和(或)rhG-CSF动员可显著促进BMSCs动员,促进血管再生,促进骨折修复。机械振动协同BMSCs动员是促进骨折愈合的较好方法。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
缩略词表  9-14
第一部分 文献综述与选题依据  14-44
  1 治疗性血管再生的研究进展  14-21
    1.1 血管再生的过程  14
    1.2 血管再生的分子机制  14-18
    1.3 治疗性血管再生  18-21
  2 影响骨折愈合的因素  21-24
    2.1 手术选择的固定方式与骨折愈合  21-22
    2.2 骨折局部因素与骨折愈合  22-23
    2.3 术后功能锻炼  23-24
    2.4 全身因素  24
  3 治疗性血管再生与骨修复  24-28
    3.1 骨的血液供应  24-25
    3.2 骨折愈合及其影响因素  25-28
  4 微动对骨折愈合的影响研究进展  28-35
    4.1 微动与骨折愈合研究进展  28-30
    4.2 微动促进骨折愈合的机制  30-32
    4.3 应力-应变促进成骨分化的力学信号传导机制  32-35
  5 骨髓干细胞  35-37
    5.1 骨髓间充质干细胞  36
    5.2 骨髓造血干细胞  36
    5.3 骨髓内皮祖细胞  36-37
  6 干细胞动员与骨骼损伤修复  37-41
    6.1 骨髓干细胞动员与损伤修复  37-41
    6.2 骨损伤修复与血管再生  41
    6.3 干细胞动员与骨损伤的血管再生  41
  7 选题依据  41-44
第二部分 大鼠闭合性骨折模型建立和机械振动协同RHG-CSF动员对骨折愈合影响的组织学研究  44-54
  1 材料与方法  44-48
    1.1 实验动物喂养及分组  44
    1.2 实验仪器设备和主要试剂  44-45
    1.3 大鼠股骨闭合性骨折模型的建立  45-46
    1.4 干细胞动员剂rhG-CSF给药方式和剂量选择  46
    1.5 机械振动方案选择  46-47
    1.6 脱钙骨组织样本取材、固定、包埋及制片方法  47
    1.7 图像采集,数据统计与分析  47-48
  2 实验结果  48-51
    2.1 模型成功率  48
    2.2 X线片结果  48
    2.3 大鼠骨折恢复期的行为观察及体重变化  48-49
    2.4 大鼠骨折部位的骨组织显微结构观察  49-51
  3 分析与讨论  51-52
    3.1 机械振动协同rhG-CSF动员对骨折大鼠恢复期的行为观察与体重变化分析  51
    3.2 X光片观察结果分析  51-52
    3.3 骨组织学变化分析  52
  4 小结  52-54
第三部分 机械振动协同RHG-CSF动员对大鼠骨折愈合过程中CD34、VEGF、ANG-1、FⅧ-RAG、CD31表达的免疫组化研究  54-62
  1 材料与方法  54-55
    1.1 实验动物分组  54
    1.2 实验仪器设备与主要试剂  54
    1.3 脱钙骨组织样本取材、固定、包埋及制片方法 #41同第二部分脱钙骨组织样本取材、固定、包埋及制片方法  54
    1.4 免疫组织化学实验方法  54-55
    1.5 图像采集与数据统计  55
  2 实验结果  55-57
    2.1 骨折部位CD34的免疫组化检测结果  55
    2.2 骨折部位VEGF的免疫组化检测结果  55-56
    2.3 骨折部位Ang-1的免疫组化检测结果  56
    2.4 骨折部位FⅧ-Rag的免疫组化检测结果  56
    2.5 骨折部位CD31的免疫组化检测结果  56-57
  3 分析与讨论  57-60
    3.1 机械振动协同rhG-CSF动员对骨折大鼠CD34+表达的影响  57-58
    3.2 机械振动协同rhG-CSF动员对骨折大鼠VEGF的影响  58-59
    3.3 机械振动协同rhG-CSF动员对骨折大鼠Ang-1表达的影响  59
    3.4 机械振动协同rhG-CSF动员对骨折大鼠FⅧ-Rag和CD31的影响  59-60
  4 小结  60-62
第四部分 机械振动协同RHG-CSF动员对骨折大鼠骨痂组织ANG-1和VEGF蛋白表达的免疫印迹研究  62-74
  1 材料与方法  62-64
    1.1 实验动物及分组  62
    1.2 主要仪器设备、试剂  62-63
    1.3 取材及样品保存  63
    1.4 骨组织蛋白提取  63
    1.5 蛋白定量  63-64
    1.6 蛋白变性  64
    1.7 SDS-PAGE凝胶电泳检测  64
  2 WESTERN BLOT方法检测蛋白表达  64-66
    2.1 凝胶电泳  64-65
    2.2 转膜  65
    2.3 封闭  65
    2.4 抗体孵育  65-66
    2.5 化学发光、显影、定影  66
    2.6 图像采集与数据统计  66
  3 实验结果  66-72
    3.1 蛋白定量数据  66-67
    3.2 标准蛋白曲线  67
    3.3 电泳结果  67-68
    3.4 Western blot实验结果  68-72
  4 小结  72-74
全文总结  74-76
参考文献  76-96
附录  96-124
致谢  124-126
攻读学位期间研究成果  126

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中图分类: > 文化、科学、教育、体育 > 体育 > 体育理论 > 体育基础科学 > 运动生理学
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