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Rap1GAP下调宫颈癌细胞—基质粘附机制的研究
作 者: 梁晓爽
导 师: 赵春艳
学 校: 大连医科大学
专 业: 临床检验诊断学
关键词: 宫颈癌 Rap1GAP 二聚体 Src 磷酸化
分类号: R737.33
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
下 载: 3次
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内容摘要
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目的：探讨抑癌基因Rap1GAP对宫颈癌Hela细胞中Src活性的影响，以期阐明Rap1GAP抑制宫颈癌Hela细胞-基质粘附的分子机制，为揭示宫颈癌发生发展的分子生物学机制提供理论依据。宫颈癌（Carcinoma of Cervix）是妇女常见的恶性肿瘤。据WHO报道世界每年宫颈癌新发病例约有46万，其中我国每年新发病例约有10万，约占1/5。宫颈癌在妇女恶性肿瘤死亡原因中居于第二位，肿瘤的转移是大多数肿瘤患者死亡的主要原因。癌细胞之间的粘附力下降而与细胞基质的粘附力增强是癌细胞向远处组织侵袭的先决条件。小G蛋白Rap1具有明显调节细胞粘附的作用，在调节整合蛋白介导的细胞基质粘附和钙粘蛋白介导的细胞间的粘附中起着重要作用。抑癌基因Rap1GAP（Rap1GTPase-activating protein）是Rap1的负性调节因子，Rap1GAP下调能够使细胞-基质、细胞-细胞之间粘附的改变。抑制Rap1GAP表达可以增强细胞-基质粘附，而细胞之间的粘附减弱，与多种肿瘤的发生发展密切相关。非受体酪氨酸蛋白激酶Src可通过CRK和C3G调节Rap1的活性。研究表明，沉默Rap1GAP表达后Src磷酸化增强，使细胞-细胞之间的粘附力下降而细胞-基质之间的粘附力增强，从而促进肿瘤细胞的转移。本组前期实验研究显示，Rap1GAP在宫颈癌组织中表达下调，过表达Rap1GAP可以通过抑制细胞-基质粘附进而抑制宫颈癌Hela细胞的迁移和侵袭，并发现Rap1GAP可以形成同源二聚体。将与二聚体形成有关的保守氨基酸位点（第90位酪氨酸和第99位组氨酸）分别进行点突变，得到Rap1GAP二聚体缺失突变体M90和M992。二聚体现象在细胞信号转导中发挥着重要作用。为了探讨Rap1GAP在宫颈癌发生发展中的作用机制，本文通过在宫颈癌细胞系Hela细胞中过表达Rap1GAP及其二聚体突变体，探讨该基因及其二聚体对Src磷酸化的影响，以期阐明Rap1GAP调控细胞-基质之间粘附作用的分子机制。方法：1.制备Rap1GAP野生体及突变体M90、M992质粒。2.采用脂质体转染法对宫颈癌Hela细胞和HEK293细胞进行转染。3.荧光显微镜观察转染效率并采用Western blot检测外源基因在细胞中的蛋白表达情况。4.Western blot方法观察过表达Rap1GAP对细胞Src蛋白磷酸化的影响。结果：1.获得了Rap1GAP野生体及突变体M90、M992质粒。2.成功将GFP、Rap1GAP野生体及突变体M90、M992质粒转染入Hela细胞和HEK293细胞并获得表达。3.Western blot结果显示：Hela细胞过表达Rap1GAP野生体及二聚体突变体M90、M992后，磷酸化Sr（cpY416）的表达量分别为（1.036±0.033）（、0.975±0.133）和（0.669±0.172），与对照组Hela-GFP（0.884±0.123）和Hela（0.865±0.146）相比，差异均无显著性（P>0.05）；4.HEK293细胞过表达Rap1GAP野生体及突变体M90、M992后，磷酸化Sr（cpY416）的表达量分别为（1.193±0.200）（、1.277±0.173）和（1.267±0.290），与对照组293-GFP（1.193±0.179）和293（1.227±0.265）对照组相比，差异均无显著性（P>0.05)。结论：1.在Hela细胞和HEK293细胞中过表达Rap1GAP不影响Src（pY416）磷酸化。2.Rap1GAP二聚体的形成不影响Src（pY416）磷酸化。3.Rap1GAP调控宫颈癌细胞-基质粘附不通过Src通路。4.Rap1GAP对Src活性的调控可能有细胞特异性。
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全文目录
摘要 6-8
Abstract 8-10
前言 10-11
材料和方法 11-18
结果 18-22
讨论 22-26
结论 26-27
参考文献 27-31
综述 31-41
参考文献 37-41
致谢 41-42
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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