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白桦脂酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及机制的研究

作　者: 陈秀玮
导　师: 张广美
学　校: 黑龙江中医药大学
专　业: 中医妇科学
关键词: 白桦脂酸 HeLa 裸鼠 移植瘤 凋亡 caspase-3 CytoC
分类号: R737.33
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 206次
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内容摘要


目的：本研究旨在探讨白桦脂酸(betulininc acid,BA)对人宫颈癌HeLa细胞及裸鼠移植瘤的增殖抑制作用及其机制。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定白桦脂酸对HeLa细胞生长的抑制作用；Hoechst33258荧光染色检测白桦脂酸处理HeLa细胞后发生凋亡的形态变化；流式细胞术(FCM)检测白桦脂酸处理HeLa细胞后诱导凋亡作用及凋亡率；蛋白印迹法检测caspase-3、CytoC等凋亡相关蛋白的表达；将4×106个HeLa细胞接种于裸鼠右肩胛皮下,建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为白桦脂酸高(80mg/kg)、中(40mg/kg)、低(20mg/kg)剂量组及溶剂组(对照组),每组6只,隔日腹腔注射给药21d,停药24h后处死裸鼠,测量荷人宫颈癌裸鼠体重,移植瘤瘤体积、瘤重,计算抑瘤率；光镜下观察移植瘤组织形态学变化；TUNEL法测凋亡指数；免疫组化法检测瘤组织内caspase-3、CytoC蛋白表达水平的变化。结果：MTT分析表明,白桦脂酸抑制HeLa细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性(P<0.01),其24、48和72h的IC50分别为20.36μg/mL、15.45μg/mL和12.02μg/mL；白桦脂酸处理HeLa细胞后,Hoechst33258染色出现典型的凋亡特征；流式细胞术检测Annexin-V/PI双染出现早期凋亡细胞,早期凋亡率为(3.27±0.43)%、(7.51±0.84)%、(18.39±2.17)%、(28.94±3.88)%,晚期凋亡率分别为(2.14±0.38)%、(16.35±2.56)%、(23.52±3.13)%、(40.38±4.27)%,早期凋亡率和晚期凋亡率与对照组比较,有显著差异(P<0.01),各处理组之间也有显著差异(P<0.01)；蛋白印迹法检测结果显示经白桦脂酸处理后HeLa细胞的caspase-3、CytoC蛋白表达均上调。与对照组相比,白桦脂酸处理组明显抑制移植瘤的生长,其高、中、低剂量组抑瘤率分别为56.2%、40.4%、24.6%,差异具有统计学意义(P<0.01)；HE染色法示白桦脂酸处理组小鼠的移植瘤组织出现明显凋亡及坏死改变；TUNEL检测发现,白桦脂酸在体内能引起移植瘤细胞的凋亡,其凋亡指数为对照组8.36±2.78,白桦脂酸低、中、高剂量组分别为20.98±3.01、28.74±4.77、39.34±6.15,凋亡指数随白桦脂酸剂量增加而增大(P<0.01)；免疫组化法示肿瘤组织内caspase-3、CytoC蛋白表达水平较对照组明显升高。结论：白桦脂酸可显著抑制人宫颈癌HeLa细胞及裸鼠移植瘤的增殖,并可能通过上调caspase-3、CytoC蛋白的表达诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡。因此从中药中寻找具有抗宫颈癌作用的新药是本文的宗旨。实验证明白桦脂酸不失为一种很有前途的抗宫颈癌中药。

全文目录


缩略语表  5-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-14
四、文献综述  14-36
  4.1 白桦脂酸的研究进展  14-28
    4.1.1 白桦脂酸的来源  14
    4.1.2 白桦脂酸生物学活性  14-26
    4.1.3 局限性及活性改造  26-28
  4.2 细胞凋亡的研究进展  28-36
    4.2.1 细胞凋亡的概念  28
    4.2.2 细胞凋亡的特征  28-29
    4.2.3 细胞调亡的分子机制  29-33
    4.2.4 细胞调亡的检测方法  33-36
五、实验方法与材料  36-55
  5.1 实验材料  36-42
    5.1.1 药物  36
    5.1.2 实验瘤株  36
    5.1.3 实验动物  36
    5.1.4 试剂  36-37
    5.1.5 主要实验仪器  37-38
    5.1.6 主要实验材料配制方法  38-42
    5.1.7 玻璃及塑料用品的准备  42
  5.2 实验方法  42-55
    5.2.1 MTT法检测白桦脂酸对HeLa细胞的增殖抑制作用  42-44
    5.2.2 Hoechst33258染色检测HeLa细胞凋亡形态学变化  44-45
    5.2.3 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡率  45-46
    5.2.4 Western-blot法检测caspase-3、CytoC蛋白表达  46-50
    5.2.5 细胞培养和动物模型的建立  50-51
    5.2.6 裸鼠日常情况观察  51
    5.2.7 裸鼠移植瘤瘤体大小测量  51
    5.2.8 测瘤重和计算抑瘤率  51
    5.2.9 裸鼠移植瘤组织病理学观察  51-52
    5.2.10 TUNEL法检测裸鼠移植瘤组织凋亡  52-53
    5.2.11 免疫组化法检测caspase-3、CytoC蛋白表达  53-54
    5.2.12 统计学分析  54-55
六、实验结果  55-60
  6.1 MTT实验结果  55-56
  6.2 Hoechst33258染色后HeLa细胞形态变化  56
  6.3 流式细胞术检测凋亡率  56-57
  6.4 蛋白印迹法检测caspase-3、CytoC蛋白的表达  57
  6.5 裸鼠一般情况  57
  6.6 裸鼠移植瘤瘤体大小测量  57-58
  6.9 Tunel法检测移植瘤组织凋亡  58
  6.10 凋亡相关蛋白caspase-3、CytoC的检测  58-60
    6.10.1 对caspase-3蛋白表达的影响  58
    6.10.2 对CytoC蛋白表达的影响  58-60
讨论  60-65
结论  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-81
附图  81-86
攻读博士期间发表的论文  86-88
个人简历  88

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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