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鼠疫耶尔森氏菌调控子Fis蛋白比较转录谱研究及其DNA结合活性分析

作　者: 马立芝
导　师: 杨瑞馥; 周冬生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌 Fis 比较转录谱 DNA结合活性
分类号: R516.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景鼠疫是由鼠疫菌引起的一种自然疫源性疾病。鼠疫菌在进化过程中,外源获得了一些毒力因子,鼠疫菌可以感应宿主体内信号刺激,紧密调控这些毒力因子的表达。在这个紧密调控过程中,调控子、毒力基因以及其他宿主适应相关基因构成了一个动态网络。研究表明,细菌内的拟核蛋白(NAPs)对经由基因水平转移获得的外源基因整合到细菌原有的转录调控网络有重要意义。Fis就是一种重要的NAPs,它能够与其他转录调控因子共同协调基因表达以使细菌响应不同生长时期和外环境的改变。Fis对E.coli的粘附、生物膜形成以及鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统的相关基因表达的调控都有重要作用。但是至今为止,人们对Fis在细菌中的作用理解的还不够深入,并且主要集中在对E.coli中Fis调控元的研究上。在本研究中,我们应用鼠疫菌全基因组DNA芯片转录谱技术,进行了不同生长时期鼠疫菌野生株和fis突变株转录谱的比较分析及Fis蛋白的DNA结合活性验证,为进一步鉴定鼠疫菌的Fis调控元、深入探究进化过程中Fis对鼠疫菌毒力相关基因调控网络重塑的作用奠定基础。方法基于Red重组系统缺失替换鼠疫菌的fis基因;应用鼠疫菌全基因组DNA芯片转录谱技术,比较不同生长时期鼠疫菌野生株和fis突变株在转录水平上的差异;应用实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)对转录谱结果进行验证。体外表达His-Fis融合蛋白,根据比较转录谱及生物信息学分析结果,选取靶基因,通过凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)验证Fis蛋白对靶DNA的结合活性。结果成功构建鼠疫菌fis::Km突变株,比较转录谱数据分析表明,在生长对数中期,与野生株相比,在fis突变株中共有193个基因发生转录下调,130个基因转录上调;在生长稳定期,共有219个基因转录下调,133个基因转录上调。芯片杂交数据与RT-qPCR验证的比较结果表明二者有较高相关性,相关系数r=0.93。凝胶迁移实验表明,Fis具有DNA结合活性,并且,很有可能同大肠杆菌的Fis蛋白一样,鼠疫菌的Fis蛋白可能也偏爱结合到高AT的DNA序列上,与RNA聚合酶或其他调控子协同作用,从而改变靶基因的转录水平。结论无论生长对数期还是稳定期,Fis都能够激活或抑制鼠疫菌一些重要基因的转录,如Ⅲ型分泌系统效应蛋白、psaAB、pla、rovA等,表明Fis可能与其它调控子一起,在鼠疫菌的代谢以及毒力因子转录的协调控制上起关键作用。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
缩略语表  9-10
前言  10-23
  1. 鼠疫菌动物流行病学特征及生存适应  10-13
  2. 鼠疫菌毒力基因进化的分子机制  13-14
  3. 细菌的拟核相关蛋白及其作用  14-21
  4. 本研究的目的及立题依据  21-23
1. 材料  23-24
  1.1 菌株，质粒  23
  1.2 酶，试剂盒  23-24
  1.3 主要仪器  24
2. 方法  24-37
  2.1 △fis 突变株的构建  24-26
  2.2 生长曲线测定  26
  2.3 比较转录谱芯片的制备  26-29
  2.4 RT-qPCR  29-33
  2.5 生物信息学分析  33
  2.6 Fis 蛋白表达纯化  33-35
  2.7 凝胶迁移实验（EMSA）  35-37
3. 结果与讨论  37-49
  3.1 △fis 突变株鉴定  37-38
  3.2 生长曲线测定  38
  3.3 比较转录谱分析  38-43
  3.4 RT-qPCR 验证  43-44
  3.5 蛋白表达纯化  44-45
  3.6 生物信息学分析  45-46
  3.7 DNA 体外结合活性分析  46-49
4. 结语  49-50
参考文献  50-54
附录一药品，试剂，溶液的配制  54-61
附录二比较转录谱芯片分析结果（表2）  61-90
综述  90-96
  参考文献  94-96
发表论文  96-108
个人简历  108-109
致谢  109

鼠疫耶尔森氏菌调控子Fis蛋白比较转录谱研究及其DNA结合活性分析

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