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病原微生物实验操作中生物气溶胶风险评估的研究

作　者: 杜茜
导　师: 李劲松
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 粘质沙雷氏菌8039 噬菌体ΦX174 生物气溶胶 Ⅱ级生物安全柜
分类号: R511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自2003年以来,随着非典型肺炎(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)、禽流感,甲型H1N1流感的爆发,病原微生物的实验室检测、研究需求急剧增加,世界各地均开始建立相应的病原微生物检测、研究实验室。病原微生物实验室不同于一般场所,它从事的是对人、畜有高度传染性,并可能产生危害的细菌、病毒、真菌、衣原体、支原体等微生物检测和研究工作的专门场所。如果防范措施不力,轻则造成实验材料的浪费,实验结果的不准确以及实验室工作人员的感染,重则因传染性病原微生物外泄,造成传染病的广泛流行,甚至可能导致某些生物灾难的发生。病原微生物实验操作中会产生大量生物气溶胶,生物气溶胶对于实验操作人员存在潜在的风险。据统计,从事病原微生物研究的工作人员发生传染病的概率比普通人群高5-7倍[1]。因此,对病原微生物实验操作中生物气溶胶风险评估的研究尤其重要。目的:通过使用指示细菌、病毒替代有传染性的细菌、病毒,研究病原微生物实验操作中产生的生物气溶胶风险,选择合适的防护手段、方法。内容:1.指示细菌粘质沙雷氏菌和指示病毒(噬菌体)ΦX174气溶胶特性的研究。2.实验操作中气溶胶风险定量研究。包括:高浓度吹吸产生的气溶胶风险实验,高浓度培养瓶破碎实验,离心管破裂实验产生的气溶胶风险,以及Ⅱ级生物安全柜的细菌、病毒气溶胶风险的研究。3.噬菌体ΦX174气溶胶实时定量PCR检测方法的建立方法:1. DV40发生器和BGI发生器在不同发生液介质中对指示微生物的损伤(10l/min流量,不同发生液介质:营养肉汤、PBS、无菌生理盐水)冲击10min,此试验决定使用哪种发生液介质。在发生液介质中发生不同时间,对指示微生物的损伤(气溶胶发生0min、5min、10min、15min、30min)。2. BGI发生器,Andersen六级采样器粒谱分布的研究。3.发生器发生量的研究。4. AGI-30采样器不同采样介质在同一采样时间的损伤(营养肉汤,PBS、无菌生理盐水,决定使用哪种介质),AGI-30采样器同一采样介质在不同时间的损伤(0min、5min、10min、15min)。5.负压实验室内用高浓度指示细菌和病毒(噬菌体)进行实验室中多种实验操作:高浓度吹吸产生的气溶胶风险实验,高浓度培养瓶破碎实验,离心管破裂实验以及Ⅱ级生物安全柜泄露产生的气溶胶风险。安德森六级采样器采样,四周摆放沉降平皿。根据采样结果得到各种实验操作产生的气溶胶风险。6.使用SYBG GreenⅠ建立噬菌体实时QPCR标准曲线,并对检测的特异性、灵敏度进行研究并应用于噬菌体ΦX174气溶胶样品定量。结果:1.粘质沙雷氏菌和噬菌体ΦX174气溶胶特性的研究中,DV40和BGI发生器不同发生液介质对指示微生物的损伤经统计分析得出PBS磷酸盐缓冲液作为发生液介质时指示细菌、病毒的存活率最高。两种发生器在同一发生液介质不同时间的损伤实验中,粘质沙雷氏菌两种发生器之间没有显著差异,噬菌体ΦX174两种发生器之间有差异;发生不同时间的存活率有差异。AGI-30采样器不同采样液介质的损伤实验中,经统计分析得出PBS磷酸盐缓冲液的耐冲击效果最好。2.在模拟的各种正常和意外事故的实验室操作中,在模拟的测试条件下高浓度气溶胶吹吸在局部环境中产生的细菌气溶胶风险最高浓度为1823cfu/m~3、病毒气溶胶最高浓度为1852pfu/m~3,高浓度培养瓶破碎产生的细菌气溶胶风险最高浓度为9326cfu/m~3、病毒为9337pfu/m~3,离心管破裂时产生的细菌气溶胶风险最高浓度为138cfu/m~3、病毒为134pfu/m~3,所得的实验结果为相关的实验室操作的风险评估提供定量的数据。3.使用建立的粘质沙雷氏菌和噬菌体ΦX174评价方法评价了Ⅱ级生物安全柜气溶胶泄露的风险,填补了目前国内外对生物安全柜病毒气溶胶泄露测试评价方法的空白。4.传统的大肠杆菌噬菌体ΦX174的定量检测方法为双层琼脂培养法,从宿主菌的培养到双层琼脂培养计数,使用大肠杆菌13706作为宿主菌,整个过程要12-16小时,快速检测方法对于噬菌体ΦX174气溶胶的相关研究具有重要意义。建立了的QPCR检测标准曲线:Ct值(Y)和对数浓度lgN(X)的直线方程为:Y=-3.38X+41.44,误差为0.014,相关系数为-0.999。本研究中气溶胶样本QPCR的检测结果是双层琼脂计数法的32.62倍,QPCR检测结果明显高于培养法的结果。而在噬菌体ΦX174新鲜的液体样本中QPCR法和培养法的符合性较好。检测的灵敏度为101pfu/反应。QPCR方法可以大大提高定量速度,从采集样本到得到检测结果只需要3-4小时。结论:本研究对粘质沙雷氏菌8039和大肠杆菌噬菌体ΦX174的气溶胶特性进行了研究,并对实验室各种常规操作和意外产生的气溶胶的风险进行了定量研究,建立了Ⅱ级生物安全柜气溶胶泄露的病毒气溶胶测试评价方法。建立了噬菌体ΦX174气溶胶实时定量检测方法,为今后实验室病毒气溶胶的风险评估建立了快速的定量方法。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-15
  1.病原微生物实验室的安全管理现状  12-13
  2.病原微生物实验室微生物危害评估  13-14
  3.病原微生物实验室风险评估  14
  4.病原微生物实验室风险防范措施  14-15
第一部分指示微生物气溶胶特性的研究  15-31
  材料  15-16
  方法  16-19
  结果  19-29
  讨论  29-31
第二部分实验室操作气溶胶风险定量研究  31-45
  一、实验操作中产生的气溶胶风险定量研究  31-36
    材料  31-32
    方法  32-33
    结果  33-35
    讨论  35-36
  二、Ⅱ级生物安全柜病毒气溶胶防护效果测试  36-45
    材料  36-37
    方法  37-40
    结果  40-43
    讨论  43-45
第三部分噬菌体气溶胶实时定量PCR 检测方法的建立  45-55
  材料  45-46
  方法  46-48
  结果  48-54
  讨论  54-55
结论  55-56
参考文献  56-61
附录  61-63
文献综述一  63-71
  参考文献  68-71
文献综述二  71-78
  参考文献  75-78
研究论著  78-86
个人简历  86-87
致谢  87

病原微生物实验操作中生物气溶胶风险评估的研究

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