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里氏木霉的紫外诱变和高活性纤维素酶突变株的选育

作 者: 覃玲灵
导 师: 何钢;陈介南
学 校: 中南林业科技大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 里氏木霉 纤维素酶 紫外诱变 优化 随机扩增多态性DNA
分类号: TQ925
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富,发展和利用生物质能源是实现经济、社会可持续发展的有效途径。在生物质原料转化利用方面,里氏木霉(Trichoderma reesei)是产纤维素酶的重要菌种之一,其生产的纤维素酶在能源、生物防治、食品等多个领域都得到了广泛的应用。本研究通过对里氏木霉进行紫外诱变,以筛选出高产纤维素酶的突变菌株,进一步提高其纤维素酶的产量,降低生产成本为目的。本文基于筛选高产纤维素酶突变菌株的目的,对里氏木霉Rut C30进行紫外诱变,筛选突变菌株,并对其突变菌株的产酶条件进行优化,通过随机扩增多态性DNA (RAPD)对出发菌株和突变菌株的基因组进行分析。对T.reesei Rut C30的孢子悬液进行紫外线诱变,确定最佳诱变时间为40s,该剂量下致死率为83.500%,正突变率为8.679%,以刚果红筛选培养基上水解圈与菌落直径的比值(H/d)为指标,进行初筛,再以液体发酵产酶进行复筛,最终获得了一株突变株A13,其滤纸酶活为4.328U/ml,相较于出发菌株2.786U/ml的酶活,提高了55.350%。对突变株A13进行6代连续培养,酶活稳定在4.160U/ml,其遗传稳定性较好。通过碳源、复合氮源、产酶温度这三个单因素优化实验,获得了突变菌株A13产酶的最佳条件,以1.000%微晶纤维素为碳源、0.150%蛋白胨与0.050%硫酸铵为复合氮源,产酶温度为28℃的条件下,突变菌株A13的滤纸酶活为4.915U/ml,比优化前的4.160U/ml提高了18.150%。在含有微晶纤维素的产酶培养基中添加适量的麦芽浸粉,实验表明,麦芽浸粉确实能促进里氏木霉的突变株产出更多的纤维素酶。当在1.000%微晶纤维素的基础上添加1.000%麦芽浸粉时,滤纸酶活提高到了5.720U/ml。采用中心复合实验设计,寻找微晶纤维素与麦芽浸粉的最佳配比。对中心复合实验设计的实验结果进行响应面分析,结果表明,在优化后的产酶条件下,当微晶纤维素和麦芽浸粉分别为13.19g/L和11.03g/L时,实际测定的滤纸酶活可以达到5.986U/ml,接近软件预测的最大值6.082U/ml。对出发菌株及4株突变菌株的基因组DNA进行RAPD分析,并对RAPD-PCR的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后,对它们的扩增条带进行聚类分析,结果显示这5株菌的遗传相似系数在0.6046512-0.8837209之间,表明它们之间有较近的亲缘关系,但存在一定的遗传变异。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 绪论  12-28
  1.1 引言  12-14
    1.1.1 生物质能源  12
    1.1.2 利用生物质的微生物  12-14
  1.2 木霉属及其纤维素酶  14-18
    1.2.1 木霉属的发展史  14
    1.2.2 木霉菌的形态特征  14
    1.2.3 里氏木霉  14-15
    1.2.4 纤维素酶  15-18
    1.2.5 纤维素酶的作用机制  18
  1.3 木霉属及其酶的应用  18-20
    1.3.1 在生物防治上的应用  18-19
    1.3.2 在工业上的应用  19-20
  1.4 诱变机理  20-22
    1.4.1 物理诱变剂  20-21
    1.4.2 化学诱变剂  21-22
  1.5 里氏木霉的高产诱变突变株选育  22-24
    1.5.1 T.reesei RUT C30  22-24
    1.5.2 T.reesei RL P37  24
    1.5.3 其他突变株  24
  1.6 突变机制  24-26
    1.6.1 基因组的特点  24-25
    1.6.2 高产突变株的基因变异  25-26
  1.7 本研究的意义和主要内容  26-28
    1.7.1 本研究的意义  26-27
    1.7.2 本研究的主要内容  27-28
第二章 紫外诱变里氏木霉  28-44
  2.1 实验材料  28-29
    2.1.1 菌种  28
    2.1.2 试剂  28
    2.1.3 培养基  28-29
    2.1.4 实验仪器  29
  2.2 实验方法  29-31
    2.2.1 孢子悬液的制备  29
    2.2.2 诱变剂量的选择  29-30
    2.2.3 紫外诱变  30
    2.2.4 突变株的初筛  30
    2.2.5 突变株的复筛  30
    2.2.6 突变株的产酶培养  30
    2.2.7 分析方法  30-31
  2.3 结果与分析  31-42
    2.3.1 诱变剂量的选择  31-32
    2.3.2 诱变后初筛菌落形态  32
    2.3.3 突变株的初筛  32-33
    2.3.4 突变株的复筛  33-34
    2.3.5 突变株的遗传稳定性  34-42
  2.4 小结  42-44
第三章 突变株液体发酵产酶培养基的优化  44-54
  3.1 实验材料  44-45
    3.1.1 菌种  44
    3.1.2 试剂  44
    3.1.3 培养基  44-45
    3.1.4 实验仪器  45
  3.2 实验方法  45-46
    3.2.1 单因素实验  45
    3.2.2 摇瓶产酶实验  45
    3.2.3 中心复合实验设计优化培养基  45
    3.2.4 分析方法  45-46
  3.3 结果与分析  46-52
    3.3.1 碳源对产酶活力的影响  46-47
    3.3.2 复合氮源对产酶活力的影响  47-48
    3.3.3 产酶温度对产酶活力的影响  48-49
    3.3.4 产酶培养基优化  49-52
  3.4 小结  52-54
第四章 里氏木霉及其突变株的RAPD分析  54-68
  4.1 实验材料  54-56
    4.1.1 菌种  54
    4.1.2 培养基  54
    4.1.3 DNA提取用主要试剂  54-55
    4.1.4 RAPD及PCR试剂  55
    4.1.5 电泳及其检测用试剂  55
    4.1.6 RAPD引物  55-56
    4.1.7 实验仪器  56
  4.2 实验方法  56-59
    4.2.1 Rut C30及其突变株的培养  56-57
    4.2.2 Rut C30及其突变株基因组DNA的提取  57-58
    4.2.3 PCR扩增反应  58
    4.2.4 RAPD体系的优化  58-59
    4.2.5 RAPD引物的筛选检测  59
    4.2.6 出发菌株与突变菌株的比较分析  59
  4.3 结果与分析  59-66
    4.3.1 Rut C30及其突变株的基因组DNA  59-60
    4.3.2 DNA模板浓度对PARD扩增的影响  60
    4.3.3 Mg~(2+)浓度对PARD扩增的影响  60-61
    4.3.4 dNTPs浓度对PARD扩增的影响  61-62
    4.3.5 引物浓度对PARD扩增的影响  62
    4.3.6 Taq聚合酶浓度对PARD扩增的影响  62-63
    4.3.7 优化后的RAPD-PCR反应体系  63
    4.3.8 RAPD结果分析  63-66
  4.4 小结  66-68
第五章 结论和创新  68-70
  5.1 结论  68-69
  5.2 创新点  69
  5.3 不足  69
  5.4 讨论  69-70
参考文献  70-79
附录A 缩略词表  79-80
附录B DNA Marker  80-81
附录C 攻读硕士学位期间的主要学术成果  81-82
致谢  82

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂(酵素)
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