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血根碱对大鼠肠平滑肌细胞活性和细胞凋亡的影响

作　者: 漆俊
导　师: 孙志良
学　校: 湖南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 血根碱 大鼠肠平滑肌细胞 细胞活性 细胞凋亡
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


血根碱(Sanguinarine,SA)是苄基异喹啉类生物碱的一种,可以从血水草块茎和某些罂粟科植物提取物中获得。它具有抗菌、抗炎、抗癌和抗肿瘤等多种药理作用,对SA抗癌机制方面的研究也逐渐开展起来,目前普遍认为其抗癌作用的产生是通过不同途径诱导癌细胞发生凋亡而实现的。基于此,本研究以体外培养的大鼠肠平滑肌细胞为模型,探讨SA对其细胞活性和细胞凋亡的影响,为其进一步的研究提供参考。1.以SD胎鼠为组织来源,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠肠平滑肌细胞(ISMCs),并进行了细胞形态学观察和免疫组织化学鉴定。结果表明,酶消化法培养的SD大鼠ISMCs呈典型的“峰-谷”样生长,细胞胞核位于细胞中央,较大；免疫组织化学法检测细胞a-actin为强阳性表达,细胞纯度达90%以上,传代细胞形态等特征未见异常改变。2.采用MTT比色法绘制ISMCs的生长曲线；再分别用终浓度为0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、40、80、100μmol/L的血根碱处理ISMCs后,采用MTT比色法检测ISMCs在12h、24h和48h三个时间点的细胞增殖情况。结果表明,ISMCs的生长曲线和一般的细胞类似,呈现“S”形,从接种细胞后的第3天开始进入对数生长期；而在细胞增殖试验中,各处理组细胞增殖率呈现剂量依赖性的降低,并且SA对细胞增殖的这种抑制作用在5μmol/L浓度时开始变得明显,三个时间点中,处理48h后同浓度下的抑制更为明显。3.为探讨SA对ISMCs的氧化损伤作用,对处理后细胞内的ROS和MDA含量进行了测定；再结合DNA Ladder法和流式细胞术检测了SA对该ISMCs的凋亡诱导作用。结果表明,在SA的诱导下,ISMCs内ROS和MDA含量随着SA浓度的增加而增加,且ROS的升高可以被抗氧化剂GSH和NAC所抑制；DNA Ladder检测未见典型的梯形条带,但流式细胞术结果显示,高浓度SA能诱导ISMCs发生细胞凋亡

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章 前言  11-25
  1 研究背景  12-13
  2 血根碱的研究进展  13-18
    2.1 血根碱的提取工艺  13-14
    2.2 血根碱的抗菌作用  14-15
    2.3 血根碱的杀虫活性  15-16
    2.4 血根碱的抗肿瘤作用  16-17
    2.5 其他  17-18
  3 氧化损伤的研究进展  18-19
  4 细胞凋亡的研究进展  19-24
    4.1 细胞凋亡特征  19
    4.2 细胞凋亡的基因调控  19-20
    4.3 细胞凋亡的检测  20-24
      4.3.1 荧光显微镜  20
      4.3.2 电子显微镜  20
      4.3.3 激光共聚焦显微镜  20-21
      4.3.4 DNA凝胶电泳法  21
      4.3.5 TUNEL法  21-22
      4.3.6 流式细胞术(FCM)  22
      4.3.7 胞内相关组分的检测  22-24
  5 本研究的目的意义  24-25
第二章 大鼠肠平滑肌细胞的原代培养和鉴定  25-35
  1 材料与方法  25-29
    1.1 试验材料  25-26
      1.1.1 试验动物  25
      1.1.2 主要试剂  25
      1.1.3 主要仪器  25-26
      1.1.4 主要试剂的配制  26
    1.2 试验方法  26-29
      1.2.1 大鼠肠平滑肌的分离和原代培养  26-28
      1.2.2 培养细胞的鉴定  28-29
      1.2.3 大鼠肠平滑肌细胞的冻存与复苏  29
  2 结果与分析  29-31
    2.1 ISMC细胞的原代培养及形态观察  29-30
    2.2 ISMC细胞的传代、冻存和复苏  30-31
    2.3 免疫细胞化学鉴定大鼠肠平滑肌细胞  31
  3 讨论  31-34
    3.1 大鼠肠平滑肌细胞的分离和鉴定  32-33
    3.2 大鼠肠平滑肌细胞的传代、冻存和复苏  33-34
  4 小结  34-35
第三章 生长曲线绘制和血根碱对细胞活率的影响  35-41
  1 材料与方法  35-37
    1.1 试验材料  35-36
      1.1.1 主要试剂  35
      1.1.2 主要仪器  35-36
      1.1.3 试剂的配制  36
    1.2 试验方法  36-37
      1.2.1 生长曲线的绘制  36
      1.2.2 MTT法检测血根碱对大鼠肠平滑肌细胞活率的影响  36-37
      1.2.3 数据分析  37
  2 结果和分析  37-39
    2.1 细胞生长曲线  37-38
    2.2 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞活率的影响  38-39
  3 讨论  39-40
    3.1 细胞生长曲线  39
    3.2 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞活率的影响  39-40
  4 小结  40-41
第四章 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞细胞凋亡的影响  41-53
  1 材料与方法  41-44
    1.1 试验材料  41-42
      1.1.1 试验动物  41
      1.1.2 主要试剂  41
      1.1.3 主要仪器  41-42
      1.1.4 试剂配制  42
    1.2 试验方法  42-44
      1.2.1 血根碱对细胞产生ROS的影响  42-43
      1.2.2 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞内MDA含量的影响  43
      1.2.3 SA对ISMC细胞DNA断裂的影响  43-44
      1.2.4 Annexin-FITC/PI双染法检测血根碱诱导细胞凋亡  44
  2 结果和分析  44-49
    2.1 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞ROS生成的影响  44-46
    2.2 SA对大鼠肠平滑肌细胞内MDA含量的影响  46-47
      2.2.1 标准曲线绘制结果  46
      2.2.2 样品测定结果  46-47
    2.3 SA对大鼠肠平滑肌细胞DNA断裂的影响  47-48
    2.4 流式细胞术检测细胞凋亡  48-49
  3 讨论  49-51
    3.1 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞的氧化损伤  49-50
    3.2 血根碱对大鼠肠平滑肌细胞凋亡的影响  50-51
  4 小结  51-53
第五章 结论和创新点  53-54
  1 结论  53
  2 创新点  53-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
作者简介  63

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 中国兽医学 > 中兽医药物学
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