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结核分枝杆菌Mtb9.9家族蛋白免疫功能的研究

作　者: 彭超
导　师: 王洪海
学　校: 复旦大学
专　业: 微生物学
关键词: 结核分枝杆菌 iTRAQ XDR Mtb9.9家族蛋白 血清学检测 免疫检测
分类号: S852.618
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,简称为M.tb)引起的一种慢性传染病。据世界卫生组织(WHO)统计,当前全球约有1/3的人感染了结核杆菌,每年死于结核病的人数达到300万。随着耐药结核的增加和HIV共感染,结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于弄清楚结核的耐药机制、有效地疫苗保护、早期诊断以及规范的多药物联合的化学治疗。目前广泛使用的唯一结核疫苗BCG的保护效果不理想,迫切需要新型结核疫苗的开发,另外改良的诊断试剂对于检测结核分枝杆菌感染是必须的,研究新的血清学诊断方法是对现有诊断方法的一个有力补充。定量蛋白质组学(quantitative proteomics)是研究结核耐药机制、找到新的疫苗和诊断候选蛋白的有力工具。我们利用定量蛋白质组学的相对和绝对定量的等量异位标签技术(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)研究了两株临床分离的广泛耐药结核(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB)和标准株H37Rv之间的差异蛋白表达。发现Mtb9.9c蛋白在两株XDR-TB中分别上调表达了1.7和21.3倍。Mtb9.9c蛋白是Mtb9.9家族中的一员。这是一组由94个氨基酸组成的相对分子质量为9.9kDa的蛋白家族,H37Rv株的Mtb9.9家族主要由Mtb9.9a (Rvl793)、 Mtb9.9c (Rvll98)、 Mtb9.9d (Rv1037c)和Mtb9.9e (Rv2346c)基因编码,其序列相互间具有高度同源性,本论文以这一家族蛋白为研究对象,探索了Mtb9.9家族蛋白作为亚单位疫苗和诊断抗原的潜力。本文成功地在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli中克隆、表达和纯化了Mtb9.9家族蛋白。将重组蛋白和弗氏不完全佐剂(IFA)联合免疫C57BL/6小、鼠,在第三次免疫后的第三周,收集小鼠血清和脾细胞进行Western Blot、细胞免疫和体液免疫检测。结果显示Mtb9.9家族蛋白之间有相似和特异的抗原表位。我们用Elispot发现了免疫小鼠产生IFN-γ的脾细胞数量增多。Elisa检测到细胞因子IFN-γ、 TNF-a的分泌量比对照多,但IL-4几乎没有变化。上述结果说明了Mtb9.9家族蛋白主要诱导Thl型细胞免疫。体液免疫检测了小鼠免疫后血清中IgG、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b和IgG2c的抗体水平,发现Mtb9.9家族蛋白能诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答,说明这是一组免疫原性抗原。另外IgG2c和IgG2b的产生量都比IgGl多,进一步证实了Mtb9.9家族蛋白诱导以Th1型为主的细胞免疫。为了进一步评估Mtb9.9家族蛋白的诊断潜力,我们克隆、表达、纯化了CFP-10蛋白做为血清学诊断的对照蛋白,来检测Mtb9.9家族蛋白针对结核病人血清以及接种BCG的健康对照者(n=61)血清的抗体反应。结核病人血清包括全敏肺结核病人的血清(n=101)、肺外结核病人(n=10)和多耐药病人血清(n=60)。结果显示在诊断耐多药病人血清方面,Mtb9.9a蛋白的敏感性可以达到75%,比对照CFP-10蛋白的敏感性53.3%要高,但是它的特异性为83.6%,略低于对照CFP-10蛋白的88.5%。研究中还发现,重组Mtb9.9a蛋白针对接种BCG的健康对照者和耐多药结核病人的血清学反应具有显著的差异(P<0.0001)。证明了Mtb9.9a蛋白具有用于耐多药结核病人的血清学诊断的潜力。这一结果在文献检索中未见报道。综上所述,Mtb9.9家族蛋白主要介导Thl型细胞免疫,具有作为亚单位疫苗的应用潜力。另外Mtb9.9a蛋白可以区别耐多药病人和健康对照,有希望作为耐多药结核病人的血清学诊断的候选抗原。

全文目录


缩略语表  5-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
第一章 结核病的现状及研究进展  14-44
  第一节 结核病现状  14-16
  第二节 结核分枝杆菌耐药现状和机制  16-22
  第三节 定量蛋白质组学在结核杆菌研究中的应用  22-27
  第四节 结核分枝杆菌诊断抗原的研究进展  27-31
  第五节 Mtb9.9家族蛋白的研究进展  31-32
  参考文献  32-44
第二章 XDR定量蛋白质组学研究及Mtb9.9家族蛋白的信息学分析  44-58
  第一节 前言  44-46
  第二节 材料与方法  46-51
  第三节 实验结果  51-54
  第四节 讨论  54-56
  参考文献  56-58
第三章 基因工程技术制备Mtb9.9家族重组蛋白  58-80
  第一节 实验材料和试剂  58-62
  第二节 实验方法  62-71
  第三节 实验结果  71-79
  第四节 讨论  79-80
第四章 Mtb9.9家族蛋白细胞免疫和体液免疫特性的研究  80-97
  第一节 实验材料和试剂  80-83
  第二节 实验方法  83-88
  第三节 实验结果  88-94
  第四节 讨论  94-96
  参考文献  96-97
第五章 Mtb9.9家族蛋白在血清学诊断中的应用潜力分析  97-121
  第一节 材料和试剂  97-99
  第二节 实验方法  99-100
  第三节 实验结果  100-114
  第四节 讨论  114-117
  参考文献  117-121
全文总结与展望  121-123
附图  123-125
博士在读期间的主要工作成果  125-126
致谢  126-127

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌 > 分枝杆菌属
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