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百合AGAMOUS同源基因的克隆、表达特性研究及载体构建

作　者: 王博
导　师: 黄海泉
学　校: 西南林业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 百合 AGAMOUS 半定量同源性反义植物表达载体
分类号: S682.29
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

百合（Lilium spp.）作为世界著名的五大切花之一，以其花朵硕大、色彩丰富、花姿优美且寓意百年好合而赢得世界人民的喜爱。但百合在生产实践仍有许多问题有待于进一步解决，如花型单一、花粉量大等。因此，如何创造出花型改良的百合新类型（如无花粉、重瓣等）一直是科学家们研究热点。本研究从3个品系7个百合品种中克隆出了14个花发育C类基因——AGAMOUS (AG)基因，并对其进行了组成及结构分析，并对其中2个品种的4个基因表达特性进行了研究，而且构建了AG基因的反义植物表达载体。主要结果如下：1.根据已报道的AG基因序列设计一对简并引物，通过RT-PCR方法，克隆得到14个花发育相关的C类基因，经比较新克隆基因与Genbank报道的AG基因有较高的同源性，并初步认定为百合花发育相关的C类基因。2.通过对新克隆的14个基因进行氨基酸序列及结构分析，发现所有序列除了具有非常保守的M区外，所有序列均含有AG I和AG II两个保守区（该特征是认定该基因属C类基因的最重要标准之一），进一步确定本研究所得到的14个基因均为与百合花发育相关的C类基因。3.运用RT-PCR半定量检测方法，对东方百合杂种系的Lilium hybrid cultivar Tiber和Lilium hybrid cultivar Siberia2个品种的AG基因时空表达情况进行了分析，发现该基因仅在花的雄蕊及雌蕊中表达，符合经典的花发育ABC模型理论；同时发现在同一部位的不同发育时期，AG基因的表达特性存在差异。4.通过对新克隆的AG基因以及同纲近缘物种的AG基因进行同源性比对和分析，发现新克隆的AG基因与Genbank中所登录的百合属植物AG基因之间同源性较高，达91%。5.根据测序结果及对载体结构的分析，重新合成一对特异引物，并在两端引入合适的酶切位点，以pBI121为基础构建了以花特异表达启动子驱动的反义植物表达载体pCLtAG1及pCLtAG2，为后期遗传转化奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
1 前言  11-19
  1.1 研究背景  11-12
  1.2 百合育种目标  12-15
    1.2.1 花色  12-13
    1.2.2 花期  13
    1.2.3 花香  13
    1.2.4 抗性  13-14
    1.2.5 保鲜及品质改良  14-15
      1.2.5.1 保鲜  14
      1.2.5.2 茎秆挺度  14-15
    1.2.6 花粉  15
  1.3 花型育种研究进展  15-18
  1.4 研究的目的意义  18-19
2 东方百合杂种系 AG 基因克隆及序列分析  19-43
  2.1 材料与试剂  19-20
    2.1.1 材料  19
    2.1.2 质粒及菌株  19
    2.1.3 试剂  19
    2.1.4 仪器  19-20
  2.2 方法  20-26
    2.2.1 东方百合Lilium hybrid cultivar Constanta AG基因的克隆  20-25
      2.2.1.1 RNA 的提取  20
      2.2.1.2 Constanta AG基因cDNA第一链的合成  20-21
      2.2.1.3 Constanta AG基因的克隆  21-22
      2.2.1.4 PCR产物的检测与回收纯化  22-23
      2.2.1.5 PCR产物的连接  23
      2.2.1.6 感受态细胞的制备  23
      2.2.1.7 连接产物的转化  23-24
      2.2.1.8 重组子的鉴定与保存  24-25
      2.2.1.9 重组子的测序  25
    2.2.2 东方百合Lilium hybrid cultivar Tiber AG基因的克隆  25
      2.2.2.1 材料  25
      2.2.2.2 方法  25
    2.2.3 东方百合Lilium hybrid cultivar Siberia AG基因的克隆  25-26
      2.2.3.1 材料  25
      2.2.3.2 方法  25-26
  2.3 结果与分析  26-43
    2.3.1 东方百合Lilium hybrid cultivar Constanta AG基因克隆  26-31
      2.3.1.1 东方百合Lilium hybrid cultivar Constanta 总 RNA电泳检测  26
      2.3.1.2 PCR 扩增 Constanta AG 基因  26
      2.3.1.3 重组子菌落 PCR 检测  26-27
      2.3.1.4 序列测定及分析  27-31
    2.3.2 东方百合 Lilium hybrid cultivar Tiber AG基因的克隆  31-36
      2.3.2.1 东方百合 Lilium hybrid cultivar Tiber总RNA电泳检测  31-32
      2.3.2.2 PCR 扩增 Tiber AG 基因  32
      2.3.2.3 重组子菌落 PCR 检测  32-33
      2.3.2.4 序列测定及分析  33-36
    2.3.3 东方百合 Lilium hybrid cultivar Siberia AG基因的克隆  36-43
      2.3.3.1 东方百合 Lilium hybrid cultivar Siberia总RNA电泳检测26  36-37
      2.3.3.2 PCR 扩增 Tiber AG 基因  37
      2.3.3.3 重组子菌落 PCR 检测  37-38
      2.3.3.4 序列测定及分析  38-43
3 OT系列百合AG基因克隆及序列分析  43-55
  3.1 材料与试剂  43
    3.1.1 材料  43
  3.2 方法  43
  3.3 结果与分析  43-55
    3.3.1 OT系列百合Lilium hybrid cultivar Conca Dor AG基因克隆  43-49
      3.3.1.1 Lilium hybrid cultivar Conca Dor总RNA电泳检测  43-44
      3.3.1.2 PCR 扩增 Conca Dor AG 基因  44
      3.3.1.3 重组子菌落 PCR 检测  44
      3.3.1.4 序列测定及分析  44-49
    3.3.2 OT 系列 Lilium hybrid cultivar Yelloween AG基因的克隆  49-55
      3.3.2.1 Lilium hybrid cultivar Yelloween总RNA电泳检测  49
      3.3.2.2 PCR扩增Yelloween AG基因  49
      3.3.2.3 重组子菌落 PCR 检测  49-50
      3.3.2.4 序列测定及分析  50-55
4 亚洲百合杂种系 AG 基因克隆及序列分析  55-66
  4.1 材料与试剂  55
    4.1.1 材料  55
  4.2 方法  55
  4.3 结果与分析  55-66
    4.3.1 亚洲百合Lilium hybrid cultivar Lemon Tree AG基因克隆  55-60
      4.3.1.1 Lilium hybrid cultivar Lemon Tree总RNA电泳检测  55-56
      4.3.1.2 PCR 扩增 Lemon Tree AG 基因  56
      4.3.1.3 重组子菌落 PCR 检测  56
      4.3.1.4 序列测定及分析  56-60
    4.3.2 亚洲百合Lilium hybrid cultivar Pisa AG基因的克隆  60-66
      4.3.2.1 Lilium hybrid cultivar Pisa总RNA电泳检测  60-61
      4.3.2.2 PCR扩增Pisa AG基因  61
      4.3.2.3 重组子菌落PCR检测  61-62
      4.3.2.4 序列测定及分析  62-66
5 Tiber 和 Siberia AG 基因表达特性研究  66-80
  5.1 Tiber AG 基因表达特性研究  66-70
    5.1.1 Tiber AG 基因表达部位检测  66-67
      5.1.1.1 Tiber 不同部位总 RNA 的提取  66
      5.1.1.2 cDNA 第一链的合成  66-67
      5.1.1.3 AG 基因的检测  67
    5.1.2 Tiber AG 半定量表达分析  67-70
      5.1.2.1 Tiber 雌蕊、雄蕊不同时期总 RNA 的提取  67
      5.1.2.2 cDNA 第一链的合成  67-69
      5.1.2.3 Tiber 内参基因 18S rRNA 循环数的确定  69-70
      5.1.2.4 Tiber AG 基因在各个时期雌蕊中的表达特性  70
      5.1.2.5 Tiber AG 基因在各个时期雄蕊中的表达特性  70
  5.2 Siberia AG 基因表达特性研究  70
  5.3 结果与分析  70-80
    5.3.1 Tiber AG 基因表达特性  70-75
      5.3.1.1 Tiber AG 基因表达部位检测  70-72
      5.3.1.2 Tiber AG 基因在雌蕊、雄蕊中的表达分析  72-75
    5.3.2 Siberia AG 基因表达特性  75-80
      5.3.2.1 Siberia AG 基因表达部位检测  75-76
      5.3.2.2 Siberia AG 基因在不同时期的雌蕊及雄蕊中的表达特性  76-80
6 百合 AG 基因同源性分析  80-89
  6.1 长片段同源性分析  80-85
    6.1.1 长片段进化树分析  80-81
    6.1.2 不同品种百合 AG 基因氨基酸序列同源性比较  81-83
    6.1.3 百合 AG 基因与近缘物种 AG 基因同源性分析  83-85
      6.1.3.1 长片段系统发育分析  83-85
  6.2 小片段同源性分析  85-89
    6.2.1 小片段进化树分析  85
    6.2.2 不同品种百合 AG 基因氨基酸序列同源性比较  85-87
    6.2.3 百合 AG 基因与近缘物种 AG 基因同源性分析  87-89
      6.2.3.1 小片段系统发育分析  87-89
7 花特异表达启动子 CHSA 驱动的 LtAG1 和 LtAG2 基因反义植物表达载体构建  89-107
  7.1 基因序列中酶切位点的引入  89-91
    7.1.1 引物的设计与合成  89
    7.1.2 LtAG1 和 LtAG2 酶切位点的引入  89-90
    7.1.3 PCR 产物的检测与回收纯化  90
    7.1.4 PCR 产物的连接  90
    7.1.5 连接产物的转化  90
    7.1.6 重组子的鉴定与保存  90-91
      7.1.6.1 重组子 PCR 检测  90-91
      7.1.6.2 重组子的保存  91
  7.2 花特异表达启动子 CHSA 的检测  91-92
  7.3 CHSA驱动LtAG1和LtAG2基因表达的反义植物表达载体的构建  92-99
    7.3.1 构建策略  92
    7.3.2 反义植物表达载体的构建  92-99
      7.3.2.1 中间载体pBI121/CHSA的构建  92-95
      7.3.2.2 反义植物表达载体pCLtAG1的构建  95-97
      7.3.2.3 反义植物表达载体pCLtAG2的构建  97-99
  7.4 结果与分析  99-107
    7.4.1 LtAG1 和 LtAG2 酶切位点的引入  99
    7.4.2 花特异表达启动子CHSA的检测  99
    7.4.3 CHSA驱动的LtAG1和LtAG2反义植物表达载体的构建  99-107
      7.4.3.1 CHSA驱动的LtAG1反义植物表达载体的构建  99-103
      7.4.3.2 反义植物表达载体 pCLtAG2 的构建  103-107
8 结论与讨论  107-112
  8.1 结论  107-108
  8.2 讨论  108-112
    8.2.1 百合AG基因的克隆  108-109
      8.2.1.1 高质量RNA的获得  108
      8.2.1.2 AG 基因的克隆  108-109
      8.2.1.3 已克隆AG基因的结构及序列分析  109
    8.2.2 Tiber及Siberia AG基因表达特性研究  109-110
    8.2.3 AG 基因系统进化及同源性分析  110
    8.2.4 载体构建  110-112
参考文献  112-117
附录一：部分实验材料图片展示  117-118
附录二：主要缩略词表  118-119
附录三：主要溶液配制  119-120
附录四：发表文章  120-121
致谢  121

百合AGAMOUS同源基因的克隆、表达特性研究及载体构建

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