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印度酸橘CrNCED1启动子克隆及胁迫响应分析
作 者: 胡双双
导 师: 刘继红
学 校: 华中农业大学
专 业: 园艺学
关键词: ABA 启动子 GUS 印度酸橘 CrNCED
分类号: S666
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
植物在生长过程要经历各种逆境,当植物受到盐害、低温、干旱等环境胁迫时,植物细胞自身会迅速积累ABA响应逆境,因此ABA是一种非常重要的逆境激素。NCED是ABA合成中的限速酶。本实验室克隆的印度酸橘基因CrNCED1受胁迫诱导,具有抗逆功能,但其转录调控机制并不清楚,因此分析CrNCED1基因启动子特有元件,研究其表达调控对阐明CrNCED1的转录调控及分离胁迫诱导启动子有至关重要的意义。1.根据甜橙数据库,利用同源序列法克隆出CrNCED1基因1989bp启动子序列。PLACE数据库分析结果显示,此段序列区域除了含有TATA盒和CAAT盒等基本元件外,还含有ABRE、MYBCORE、BIHD10S、ERELEE4、GT1GMCAM4S等与逆境密切相关的元件。它们集中分布在ATG上游的1000bp左右。2.设计引物扩增了1058bp的启动子片段,将其连接到酶切掉CaMV35S启动子的pCAMBIA1391双元表达载体上,农杆菌介导法转化烟草,通过潮霉素筛选,,获得了烟草转基因植株。试验中发现,单纯的DNA提取,PCR鉴定并不能获得具有GUS活性的阳性植株,但是将DNA鉴定出来的植株进一步提取RNA反转录获得的cDNA进行鉴定,获得的植株一定是阳性株,通过此方法获得转基因株系#7和#8系。3.进行组织特异性分析,选取转基因株系(#7、#8)进行GUS染色。结果表明,种子和果荚,没有GUS基因表达,在叶片和果蒂中有较高的GUS表达。利用震动切片和微分干涉仪进行根部染色观察,发现根中柱部位GUS表达量很高,但是在根尖和其他区域却没有表达。4.对转基因株系(#7、#8)进行了脱水、ABA和甘露醇胁迫处理,发现三种处理都能促进转基因株系GUS活性,尤其是幼嫩叶片中,GUS活性明显增强。通过测定GUS荧光活性也证明启动子能够响应脱水、ABA和甘露醇。上述结果表明,该启动子是一个胁迫诱导型启动子。
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全文目录
摘要 6-7 ABSTRACT 7-8 缩略词表(Abbreviation) 8-9 1 前言 9-23 1.1 课题的提出 9-10 1.2 前人研究进展 10-22 1.2.1 ABA的发现及其在逆境中的主要生理作用 10-11 1.2.2 ABA调控渗透胁迫的主要机制 11-13 1.2.3 ABA的合成及其过程中的限速酶 13-15 1.2.4 启动子结构概述 15-18 1.2.5 启动子的分类 18-22 1.3 本课题研究内容 22-23 2. 材料与方法 23-40 2.1 材料与试剂 23-24 2.1.1 植物材料 23 2.1.2 载体和菌株 23 2.1.3 试剂盒及酶 23-24 2.2 启动子全长的克隆及分析 24-28 2.2.1 CrNCED1启动子的引物设计 24 2.2.2 CTAB大量法提取植物基因组DNA 24-25 2.2.3 CrNCED1启动子的扩增 25 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳及目的片段的回收 25-26 2.2.5 目的片段与T载体的连接 26 2.2.6 连接产物转化大肠杆菌及阳性克隆鉴定 26-28 2.2.7 启动子全长序列获得及其生物信息学分析 28 2.3 基因上游元件密集区的启动子克隆及分析 28-33 2.3.1 N_1启动子克隆片段的引物设计 28 2.3.2 N_1启动子克隆片段T载体的构建 28-29 2.3.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 29 2.3.4 质粒的酶切及检测 29-30 2.3.5 酶切产物的回收 30-31 2.3.6 表达载体的连接 31 2.3.7 连接产物转化农杆菌及阳性克隆鉴定 31-33 2.4 烟草叶片的农杆菌转化及植株再生 33-34 2.4.1 烟草种子灭菌及播种 33 2.4.2 烟草叶片的农杆菌转化 33-34 2.5 T_0代烟草的鉴定 34-36 2.5.1 小样法提取烟草DNA 34-35 2.5.2 转基因烟草的PCR鉴定 35 2.5.3 Trizol试剂盒法提取烟草RNA 35-36 2.5.4 RNA的反转录 36 2.6 转基因烟草的组织化学染色 36-38 2.6.1 烟草组织化学染色GUS染液的配置 36-37 2.6.2 烟草组织化学染色 37 2.6.3 组织化学染色结果的观察 37-38 2.7 烟草的胁迫处理及染色 38 2.8 烟草GUS活性的荧光定量分析及总蛋白的测定 38-40 3 结果与分析 40-48 3.1 同源序列法扩增印度酸橘CrNCED1启动子 40 3.2 启动子全长片段的生物信息学分析 40-43 3.3 N_1双元表达载体的构建 43-44 3.4 烟草转基因植株鉴定 44-45 3.5 T_0代烟草的组织特异性分析 45 3.6 T_1代烟草的抗逆性分析 45-48 4 讨论 48-51 4.1 启动子转基因植株鉴定方法探讨 48 4.2 启动子启动基因的组织特异性分析 48-49 4.3 启动子的抗逆性分析 49-51 参考文献 51-58 图版及说明 58-61 致谢 61
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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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