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木薯块根发育与淀粉累积相关的microRNA及其靶基因

作　者: 张何芳
导　师: 王文泉
学　校: 海南大学
专　业: 种质资源学
关键词: 木薯 淀粉合成 miRNAs 靶基因
分类号: S533
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


microRNA（miRNA）是一类21-24nt非编码的小RNA分子,通过不同层次（转录、转录后、翻译等）调控重要的靶基因,miRNA的调控作用涉及几乎所有重要的生物学过程。木薯为热带地区重要的粮食与能源作物,是世界上六亿人赖于生存的食物之一。木薯具有块根淀粉产量高、抗旱耐贫瘠等重要生物学特性,找到在木薯块根发育与淀粉累积中起到关键作用的miRNA及其靶基因,将为木薯分子育种提供一个全新的策略。本研究选择了高淀粉栽培品种Arg7和低淀粉野生品种W14,构建了Arg7叶、Arg7块根和W14块根三个小RNA文库,通过高通量Solexa测序技术和基于全基因组序列信息的miRNA预测方法,挖掘木薯块根发育和淀粉累积过程中相关的miRNA及其靶基因。并结合实时定量PCR（Real-time PCR）对部分重要候选miRNA及其靶基因进行表达验证,主要研究结果如下：（1）通过Solexa深度测序技术和生物信息学分析,从3个小RNA文库（Arg7leaf、 Arg7root和W14root）中共发现了167个miRNA,其中93个为保守的miRNA,可归属于21个miRNA家族,另外74个为新发现的miRNA。对此167个1miRNA reads归一化处理,设定超过1000个reads的为高表达的miRNA,在Arg7leaf中高表达miRNA81个,在Arg7root中高表达的57个,在W14root中的为58个；在3个文库中均高表达的有48个；在高淀粉品种Arg7中高表达且在根中表达量高于叶片的miRNA有：novel42、miR394abc、novel52、novel20、miR319bcdef和miR164bcd。（2）利用Hitsensor软件对167个miRNA进行了靶基因预测,在美国能源部JGI的木薯CDS序列（http://www.phytozome.net/cassava）数据库中搜索所有miRNA分子的互补序列。最终93个保守的miRNAs对应的靶基因146个,74个新的miRNAs对应的靶基因115个。靶基因的功能可分为以下四类：代谢、转录因子、信号传导和胁迫蛋白。其中与糖代谢和淀粉合成相关的靶基因及相应的miRNA主要有：SPS2F （miR394abc）、 ADP-Glucose Pyrophosphorylase （AGPase）（miR394abc）.3-ketoacyl-CoA synthase11（novel-52）、starch synthase （miR159）、和UDP-glycosyltransferase （miR156）等。（3）用Multiplexed RT法实验验证了83个：niRNA在木薯叶片和块根中的表达,在Arg7块根中高表达的有6个miRNA,分别为miR172d、miR396c、miR398a、miR398b、miR399e和1miR399f,叶片中高表达的有13个,miR160b, novel-10, novel-19, novel-20, novel-22, novel-50, novel-51, novel-6ab, nevel-43abcd, novel-31abcd, miR164abcd, novel-55-3p;须根中高表达的有3个,miR397, miR169defg和novel-42。（4）用Real-time PCR对28个miRNA的进行了相对定量分析。结果表明,在幼苗期高表达的有：miR169abcd和novel-52;膨大期高表达的有：novel-2、novel-20、novel-50、 novel-55-3p、miR398a、miR399e和miR399f;成熟期高表达的有：miR160b、miR394abc、 novel-6ab、novel-10、novel-19、novel-31abcd、novel-43ab novel-51和novel-42,相对定量分析的结果与测序结果较一致。（5）综合测序、相对定量分析和靶基因预测结果,选取miR394的两个靶基因SPS2F和AGPase进行相对定量分析,并比较miR394调控两个靶基因的结果。在miR394高表达的块根成熟期,两个靶基因均下调表达,利用SAS软件对两个靶基因与miR394分别进行一元回归相关性分析,相关系数分别为-0.9975,-0.5350,呈负相关的关系。从结论上初步得出miR394在块根发育中对上述两个基因存在负调控作用,该研究结果为进一步阐明调控机理奠定基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1. 文献综述  11-31
  1.1 木薯生物学特性及木薯淀粉的研究进展  11-14
    1.1.1 木薯的生物学特性  11
    1.1.2 木薯的经济价值  11
    1.1.3 块根发育及淀粉积累机制研究进展  11-14
      1.1.3.1 块根的形成和膨大机理研究  12
      1.1.3.2 木薯块根发育和淀粉累积  12
      1.1.3.3 光合作用与淀粉合成关键基因  12-14
  1.2 miRNA研究进展  14-30
    1.2.1 miRNA的发现及现状  14-15
    1.2.2 miRNA的特性  15-16
    1.2.3 miRNA的生物合成  16-18
    1.2.4 植物miRNA的作用机制  18-19
    1.2.5 miRNA功能  19-22
      1.2.5.1 植物miRNA对植物生长发育的影响  19-20
      1.2.5.2 miRNA与植物抗逆胁迫  20-22
      1.2.5.3 miRNA自我调节  22
    1.2.6 miRNA的研究方法  22-29
      1.2.6.1 生物信息学方法研究miRNA  23
      1.2.6.2 生化实验方法研究miRNA  23-24
      1.2.6.3 高通量测序技术推动小RNA的研究  24-26
      1.2.6.4 miRNA的鉴定方法与定量检测技术  26-29
    1.2.7 靶基因的实验验证  29-30
  1.3 本研究的目的与意义  30
  1.4 课题设计思路及技术路线  30-31
2. 材料与方法  31-43
  2.1 仪器与试剂  31
  2.2 植物材料  31-32
  2.3 实验方法  32-43
    2.3.1 miRNA的获取  32
    2.3.2 小RNA文库的构建、测序及数据分析  32-33
      2.3.2.1 miRNA提取  32-33
      2.3.2.2 小RNA文库的构建、测序及数据分析  33
    2.3.3 靶基因的预测  33-34
    2.3.4 Multiplexed RT法检测测序得到的miRNA  34-40
      2.3.4.1 引物设计  34-39
      2.3.4.2 第一链cDNA合成及检测  39
      2.3.4.3 U6及miRNA标准曲线的制作  39-40
      2.3.4.4 miRNA的相对定量分析  40
    2.3.5 靶mRNA的RT-PCR检测  40-43
      2.3.5.1 靶基因的引物设计  40
      2.3.5.2 内参基因Actin引物设计  40-41
      2.3.5.3 总RNA提取  41
      2.3.5.4 cDNA第一链的合成及预实验  41-42
      2.3.5.5 靶基因的表达分析  42-43
3. 结果与分析  43-63
  3.1 小RNA测序数据处理及片段长度分布  43-44
  3.2 miRNA首位碱基组成  44
  3.3 品种间miRNA序列差异分析  44-45
  3.4 木薯块根及叶片中的miRNA  45-46
  3.5 块根及叶片中的miRNA的丰度分析  46-47
  3.6 miRNA靶基因预测结果  47-49
  3.7 部分miRNA的实验验证  49-51
  3.8 部分miRNA在根和叶片的Q-PCR表达分析  51-58
    3.8.1 Q-PCR检测的标准体系  51-54
    3.8.2 miRNA的相对定量分析  54-58
  3.9 miRNA靶基因的qPCR分析  58-63
    3.9.1 总RNA的提取  59
    3.9.2 mRNA Q-PCR检测的标准体系  59-60
    3.9.3 miRNA与靶基因AGPase和SPS2F对应表达分析  60-63
4. 讨论  63-66
  4.1 miRNA序列长度及碱基偏好性  63
  4.2 Solexa测序技术  63-64
  4.3 miR394与靶基因SPS2F,AGPase  64
  4.4 关于miRNA表达验证方法  64-66
5. 结论  66-67
参考文献  67-74
附录  74-83
致谢  83

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 木薯（树薯）
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