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重组纤维素结合域的吸附特性及纸浆增强作用

作　者: 石翛然
导　师: 丁少军
学　校: 南京林业大学
专　业: 生物化工
关键词: 纤维素结合域 草菇 热纤梭菌 吸附 纸张性能
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文根据来自于草菇cbh 1-1(CBD1)和热纤梭菌的cipB(CBM3)的CBD序列设计了—系列相互重叠的引物,利用PCR的方法得到含双纤维素结合域的基因片段。通过限制性内切酶酶切连接后与表达质粒pET-32b相连,再转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE检测到四种目的蛋白CBM3-GS-CBD1、CBM3-celc-CBD1、CBM3-GS-CBM3、CBD1-celc-CBD1均能正确表达。CBD1-celc-CBD1仅在诱导温度降低至20℃时才会出现可溶性表达,其余重组蛋白在30℃时即可得到可溶性蛋白。采用NI-NTA亲和纯化的方法得到了纯化的目的蛋白,比较它们对Avice1、磷酸润涨纤维素、Whatman 1号滤纸及纸浆的吸附特性：(1)家族1 CBD对结晶型纤维素吸附量最高,其中CBD1-celc-CBD1对Wicel的吸附最大值为CBM3-GS-CBM3的三倍。CBM3-GS-CBD1则对磷酸润涨纤维素吸附最高,对(?)Whatman 1号滤纸吸附最多的为CBM3-celc-CBD1,对纸浆吸附量较高的为CBD1-celc-CBD1。(2)连接肽(linker)也对吸附有一定的影响,含有弹性linker的CBM3-GS-CBD1更倾向于吸附Avicel,而含有草菇外切-β-葡聚糖酶CBH I-I native linker的CBM3-celc-CBD1吸附Whatman 1号滤纸能力更强。(3)此外,我们研究了四种蛋白对(?)Wicel吸附的可逆性,其中仅有CBD1-celc-CBD1的吸附是可逆的。在对纸张机械性能的影响上,CBM3-GS-CBM3对纸张耐折度和抗张强度的增加最为明显,分别提高了27.4%和15.5%。CBD1-celc-CBD1也有16.7%和12.6%的提高。CBM3-GS-CBD1、CBM3-celc-CBD1对纸浆有一定的助滤作用。经四种蛋白处理的纸张防水性均有提高。本论文首次系统的研究了草菇CBH I-I的CBD和热纤梭菌CipB的CBD的吸附特性及差异,和它们在纸张性能改善方面的应用。同时,首次比较了不同构造的连接肽对双CBD融合蛋白的影响。以上结果显示,重组蛋白可用于改善纸品纤维的表面性质和机械性能。此外,家族1的CBD能够可逆性吸附纤维素这一特点还可用于纤维再利用。本文为开发一种新型生物纸浆增强剂提供了理论依据和实践基础。

全文目录


致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-19
  1.1 纤维素酶  10-11
    1.1.1 纤维素酶的组成及分类  10
    1.1.2 纤维素酶的结构  10-11
  1.2 连接肽(linker)  11-12
  1.3 纤维素结合域(CBD)  12-17
    1.3.1 CBD的来源和分类  12-13
    1.3.2 CBD的结构和功能  13-14
      1.3.2.1 来自家族1和3的CBD  13-14
    1.3.3 CBD的应用  14-17
      1.3.3.1 CBD在纤维修饰及造纸工业的应用  14-16
      1.3.3.2 CBD在固定化、亲和层析及蛋白质工程上的应用  16-17
  1.4 论文的研究意义和研究目的  17-19
第二章 包含双CBD基因片段重组质粒的构建  19-44
  2.1 材料  19-21
    2.1.1 菌种  19
    2.1.2 质粒  19
    2.1.3 药品  19
    2.1.4 工具酶  19
    2.1.5 仪器  19-20
    2.1.6 培养基  20-21
  2.2 方法  21-31
    2.2.1 cbm3基因的人工合成  21-24
    2.2.2 dCBD重组基因的合成  24-28
      2.2.2.1 cbm3-gs-cbd1的合成  24-25
      2.2.2.2 cbm3-celc-cbd1的构建  25-26
      2.2.2.3 cbm3-gs-cbm3的构建  26-27
      2.2.2.4 cbd1-celc-cbd1的构建  27-28
    2.2.3 基因片段与T载体PCR2.1连接  28
    2.2.4 重组质粒dCBD-PCR2.1转化大肠杆菌  28-29
    2.2.5 重组质粒dCBD-PCR2.1阳性克隆的筛选  29-30
    2.2.6 重组表达质粒dCBD-pET 32b的构建及筛选  30-31
  2.3 结果  31-40
    2.3.1 cbm3基因片段的构建  31-33
    2.3.2 目的基因的构建  33-39
      2.3.2.1 cbm3-gs-cbd1的合成  33-35
      2.3.2.2 cbm3-celc-cbd1的合成  35-36
      2.3.2.3 cbm3-gs-cbm3的合成  36-37
      2.3.2.4 cbd1-celc-cbd1的合成  37-39
    2.3.3 重组质粒dCBD-PCR2.1阳性克隆的筛选  39-40
  2.4 重组表达质粒dCBD-pET 32b的构建  40-43
  2.5 讨论  43
  2.6 本章小结  43-44
第三章 重组蛋白表达及可溶性研究  44-59
  3.1 材料  44-45
    3.1.1 菌种  44
    3.1.2 试剂  44
    3.1.3 培养基  44
    3.1.4 缓冲液  44-45
  3.2 方法  45-47
    3.2.1 重组表达菌株的构建  45
    3.2.2 重组蛋白的表达  45
    3.2.3 表达结果的SDS-PAGE分析  45-47
      3.2.3.1 溶液的配制  45-46
      3.2.3.2 分离胶和浓缩胶的配制  46
      3.2.3.3 样品的准备  46
      3.2.3.4 加样  46
      3.3.3.5 电泳  46
      3.2.3.6 染色与脱色  46-47
    3.2.4 目的蛋白可溶性表达最优条件的研究  47
      3.2.4.1 不同温度对可溶性表达的影响  47
      3.2.4.2 不同IPTG诱导浓度对可溶性表达的影响  47
    3.2.5 Native条件下的亲和纯化验证  47
  3.3 结果  47-57
    3.3.1 重组表达菌株的构建  47-48
    3.3.2 重组表达蛋白的诱导表达  48-49
    3.3.3 重组表达蛋白的可溶性研究  49-53
      3.3.3.1 CBM3-GS-CBD1的可溶性研究  50
      3.3.3.2 CBM3-celc-CBD1的可溶性研究  50-51
      3.3.3.3 CBM3-GS-CBM3的可溶性研究  51-52
      3.3.3.4 CBD1-celc-CBDl的可溶性研究  52-53
    3.3.4 IPTG浓度对蛋白可溶性表达的影响  53-55
    3.3.5 重组蛋白的纯化  55-57
  3.4 讨论  57-58
  3.5 小结  58-59
第四章 重组蛋白吸附性能的比较  59-71
  4.1 材料  59
    4.1.1 试剂  59
    4.1.2 缓冲液  59
  4.2 方法  59-60
    4.2.1 重组蛋白吸附性能的研究  59-60
      4.2.1.1 重组蛋白对不同底物吸附的研究  59
      4.2.1.2 重组蛋白可逆性吸附的研究  59-60
  4.3 结果  60-69
    4.3.1 重组蛋白对不同底物的吸附  60-64
      4.3.1.1 重组蛋白对Avicel的吸附  60-61
      4.3.1.2 重组蛋白对磷酸润涨纤维素的吸附  61-62
      4.3.1.3 重组蛋白对Whatman 1号滤纸的吸附  62-63
      4.3.1.4 重组蛋白对纸浆的吸附  63-64
    4.3.2 重组蛋白可逆性吸附的研究  64-69
  4.4 讨论  69-70
    4.4.1 重组蛋白吸附特性的研究  69-70
    4.4.2 重组蛋白可逆性的研究  70
  4.5 小结  70-71
第五章 重组蛋白及对纸张性能影响的初步研究  71-83
  5.1 材料  71
    5.1.1 缓冲液  71
    5.1.2 仪器和设备  71
  5.2 方法  71-74
    5.2.1 蛋白浓度的测定  71-72
    5.2.2 打浆  72
    5.2.3 抄片  72
    5.2.4 纸张机械性能的测定  72-74
      5.2.4.1 耐折度的测定  72-73
      5.2.4.2 抗张强度的测定  73
      5.2.4.3 耐破度的测定  73-74
    5.2.5 滤水速度的测定  74
    5.2.6 纸张防水性的测定  74
  5.3 结果  74-81
    5.3.1 蛋白浓度的测定  74-75
    5.3.2 重组蛋白对纸张耐折度的影响  75-76
    5.3.3 重组蛋白对纸张抗张强度的影响  76-77
    5.3.4 重组蛋白对纸张耐破度的影响  77-78
    5.3.5 重组蛋白对纸浆滤水性的影响  78-79
    5.3.6 重组蛋白对纸张防水性的影响  79-81
  5.4 讨论  81-82
    5.4.1 重组蛋白对纸张性能的影响  81
    5.4.2 重组蛋白对纸张滤水性的影响  81-82
    5.4.3 重组蛋白对纸张防水性的影响  82
  5.5 小结  82-83
结论  83-84
参考文献  84-89
详细摘要  89-90
Abstract  90-91

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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