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基于介孔材料负载的光学免疫探针

作　者: 赵月
导　师: 林洁华
学　校: 青岛科技大学
专　业: 分析化学
关键词: 甲胎蛋白癌胚抗原化学发光免疫分析流动注射介孔材料辣根过氧化物酶鲁米诺肿瘤标志物
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本论文的研究工作中引入介孔SBA-15等纳米粒子固定蛋白质,构建新型化学发光和荧光免疫探针。主要研究工作如下:1.提出了一种基于辣根过氧化物酶(HRP)和酶标抗体共同修饰的介孔SiO2纳米粒子(HRP-Ab2/SiO2)作为超灵敏免疫探针的制备新方法,并成功应用于人血清样品中甲胎蛋白(AFP)的灵敏检测。将AFP单抗固定在Au/SiO2介孔纳米粒子修饰的玻片,作为一抗,HRP-Ab2/SiO2探针作为二抗,基于夹心式免疫分析模式,检测AFP的含量。介孔SiO2由于具有较大的比表面积和交错的多维孔道,可以大大提高生物分子的的负载量,使得在每个微球上能够负载更多的HRP和AFP酶标二抗,使鲁米诺和H2O2的化学发光信号得到放大,拓宽了检测的线性范围。在优化的实验条件下,AFP在0.01 to 0.5 ng mL-1和0.5 to 100 ng mL-1二段范围内呈线性相关,检测限为0.005 ng mL-1 (3σ)。该免疫探针也可以应用于其他抗原或其他生物活性分子。2.将化学发光检测和流动注射技术相结合,基于药物释放原理,制备了一种基于底物鲁米诺释放的化学发光免疫探针,用于免标记免疫测定AFP的含量。采用氯硅烷来封闭介孔SiO2外壁的羟基活性基团,减少外壁对蛋白质或鲁米诺底物的化学吸附;对介孔SiO2基的内孔道则修饰羧基官能团,用于吸附大量的鲁米诺,并用于后期固定AFP单克隆抗体,制备免标记化学发光免疫探针。通过调节溶液的pH来调控鲁米诺的释放。当免疫反应结束后,形成的免疫复合物由于空间位阻的增大,会影响鲁米诺从孔道内部向溶液中的扩散,从而可以间接地定量溶液中抗原的含量。我们还对所制备的免疫探针进行了临床验证,表明该方法具有一定的准确性。3.提出了一种基于介孔磁性材料(Fe3O4/SBA-15)的二组分化学发光免疫传感系统,用于同时检测两种重要的肿瘤标志物:AFP和癌胚抗原(CEA)。采用具有较大的比表面积的介孔SiO2纳米粒子负载更多的单抗和辣根过氧化物酶(HRP)作为一抗,采用纳米金粒子负载抗原和Luminol底物分子来制备标记抗原,采用竞争免疫反应模式,来同时测定AFP和CEA的含量。加入待测抗原和标记抗原,当免疫反应结束后,通入H2O2,在固定化HRP的催化作用下,在两个检测通道里分别产生相对应于AFP和CEA二种抗原的化学发光信号,并在光门的辅助下分别检测两个通道中的信号。随着样品抗原浓度的增加,结合到流通池内的标记抗原的量就减少,化学发光信号也随之下降,AFP在浓度为1.0 - 100 ng mL?1范围内呈线性关系,而CEA在浓度为1.0 - 80 ng mL?1范围内呈线性关系,检测限为0.2 ng mL?1(3σ)。4.提出了一种基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记荧光抗体修饰介孔SiO2的超灵敏标记探针,并成功用于检测人血清中甲胎蛋白(AFP)的含量。本方法通过EDC/NHS交联剂将FITC标记抗体固定在氨基功能化的介孔SBA-15上,制备得到抗体修饰介孔SBA-15的信号放大型荧光免疫探针(FITC-Ab*/ SBA-15)。将AFP单克隆抗体固定在纳米金/介孔SBA-15修饰的玻璃片上,然后植入流动注射体系,构建免疫检测流通池。基于夹心式免疫反应模式,结合流动注射分析技术,待测抗原与FITC-Ab*/SBA-15顺序注射到免疫流通池。免疫反应结束后,FITC-Ab*/SBA-15被引入到流通池的玻璃载体表面,进行荧光检测。介孔SBA-15纳米粒子由于具有较大的比表面积和交错的多维孔道,可以大大提高生物分子的的负载量,使得在每个微球上能够负载更多的FITC标记二抗,使荧光信号得到放大,拓宽了检测的线性范围。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章前言  11-24
  1 综述  11-19
    1.1 多组分免疫分析技术  11
    1.2 免疫传感器  11-15
      1.2.1 免疫传感器的基本原理  12
      1.2.2 免疫传感器的主要类型  12-15
        1.2.2.1 微重量免疫传感器  12-13
        1.2.2.2 光学免疫传感器  13-14
        1.2.2.3 电化学免疫传感器  14-15
    1.3 肿瘤标志物  15-16
    1.4 纳米材料在生物传感器中的应用  16-17
      1.4.1 用金纳米粒子构建生物传感器  16-17
      1.4.2 介孔材料  17
    1.5 药物释放  17-18
    1.6 本论文基本思路及目的  18-19
  参考文献  19-24
第二章基于酶修饰介孔 SiO_2粒子作为灵敏标记物的信号放大型免疫传感器  24-36
  2.1 引言  24-25
  2.2 实验部分  25-27
    2.2.1 试剂  25
    2.2.2 仪器  25
    2.2.3 介孔 SBA-15 的制备  25-26
    2.2.4 AFP 免疫流通池的制备  26
    2.2.5 酶修饰的介孔SiO_2灵敏标记物的制备  26
    2.2.6 流动注射免疫测定AFP  26-27
  2.3 结果与讨论  27-32
    2.3.1 介孔材料的表征  27-28
    2.3.2 纳米金对化学发光体系的增敏作用  28-29
    2.3.3 酶修饰介孔SiO_2灵敏标记物的信号放大  29-30
    2.3.4 免疫测定条件的条件优化  30
    2.3.5 AFP 测定校正曲线  30-31
    2.3.6 AFP 免疫传感器的稳定性和再现性  31
    2.3.7 准确性和临床验证  31-32
    2.3.8 交叉干扰反应  32
  2.4 结论  32-34
  参考文献  34-36
第三章基于负载在介孔 SiO_2内的鲁米诺释放原理的免标记化学发光免疫传感器  36-45
  3.1 前言  36-37
  3.2 实验部分  37-39
    3.2.1 试剂  37
    3.2.2 仪器  37
    3.2.3 介孔 SBA-15 的制备  37
    3.2.4 羧基修饰的 SBA-15 材料的制备  37-38
    3.2.5 制备羧基修饰的SBA-15- Luminol 材料  38
    3.2.6 AFP 免疫流通池的制备  38
    3.2.7 流动注射免疫测定 AFP  38-39
  3.3 结果与讨论  39-43
    3.3.1 介孔材料的表征  39-40
    3.3.2 免疫测定条件的优化  40-41
    3.3.3 AFP 测定校正曲线  41-42
    3.3.4 AFP 免疫传感器的稳定性和再现性  42
    3.3.5 准确性和临床应用  42
    3.3.6 交叉干扰反应  42-43
  3.4 结论  43-44
  参考文献  44-45
第四章基于介孔磁性材料修饰的新型免疫传感器同时测定甲胎蛋白和癌胚抗原  45-54
  4.1 引言  45
  4.2 实验部分  45-48
    4.2.1 试剂  45-46
    4.2.2 仪器  46
    4.2.3 Fe304/SBA-15-NH2 磁性介孔材料的制备  46-47
    4.2.4 AuNPs-MPA-Luminol-AFP 免疫复合物的制备  47
    4.2.5 羧基修饰的玻璃片的制备  47
    4.2.6 两种肿瘤标志物的联合检测  47-48
  4.3 结果与讨论  48-51
    4.3.1 免疫测定条件的优化  48-49
    4.3.2 AFP 测定校正曲线  49-50
    4.3.3 交叉干扰反应  50
    4.3.4 AFP 免疫传感器的稳定性和再现性  50-51
  4.4 结论  51-52
  参考文献  52-54
第五章基于荧光抗体修饰介孔 SBA-15 的信号放大型免疫探针的制备  54-61
  5.1 前言  54-55
  5.2 实验部分  55-56
    5.2.1 试剂与仪器试剂  55
    5.2.2 AFP 免疫流通池的制备  55
    5.2.3 信号放大型荧光免疫探针的制备  55
    5.2.4 荧光免疫探针测定 AFP  55-56
  5.3 结果与讨论  56-59
    5.3.1 FITC 修饰介孔 SiO_2 灵敏标记物的信号放大  56-57
    5.3.2 AFP 测定校正曲线  57-58
    5.3.3 AFP 免疫传感器的稳定性和再现性  58
    5.3.4 准确性和临床应用  58
    5.3.5 交叉干扰反应  58-59
  5.4 结论  59-60
  参考文献  60-61
结论  61-62
致谢  62-63
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  63-64

基于介孔材料负载的光学免疫探针

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