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绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烯不对称水解反应

作 者: 陈文静
导 师: 宗敏华
学 校: 华南理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 绿豆环氧化物水解酶 环氧苯乙烯 (R)-苯基乙二醇 离子液体 不对称水解
分类号: O643.32
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


光学活性的环氧化物和邻位二醇是精细有机合成中极为重要的手性合成子,在医药和农药等行业具有重要的应用价值。利用环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)催化外消旋环氧化物的不对称水解可制备手性纯的邻位二醇。该过程因具有高对映体选择性、反应条件温和及环境污染小等优点而渐受青睐。在生物合成手性纯的邻位二醇方面,来源广泛、价格低廉的绿豆EHs表现出巨大的应用潜力。目前仅报道了水相中绿豆EHs催化对硝基环氧苯乙烯的水解反应。当反应在水相体系中进行时,环氧化物易发生非酶水解反应,导致产物的e.e.值下降;此外,一般情况下环氧化物在水相中的溶解性较差,反应底物的浓度偏低,导致反应效率较低。迄今,在其它反应介质(如含有机溶剂反应体系、含离子液体反应体系)中绿豆EHs催化环氧化物水解的研究尚未见报道。近年来,离子液体(Ionic liquids,ILs)作为绿色反应介质应用于生物催化已引起了人们广泛的关注。现有的研究结果表明,许多酶在含ILs介质中具有较高的活性、选择性及稳定性,故含ILs介质中的生物催化反应具有广阔的应用前景。因此,本论文对比研究不同反应介质(尤其是含ILs介质)中绿豆EHs催化环氧苯乙烯(Styrene oxide, SO)不对称水解为(R)-苯基乙二醇(PED)的反应特性,并系统探讨各相关因素对该反应的影响规律,揭示在含ILs介质中绿豆EHs催化特性,并建立高效、高选择性地合成对映体纯(R)-PED的生物催化反应体系。在水相反应体系中,底物SO溶解度低并存在明显的非酶水解。绿豆EHs催化SO不对称水解反应的最适反应温度、缓冲液pH值、振荡速度和底物浓度分别是35℃、6.5、220r/min、5mmol/L;在此条件下,该反应初速度、产率及产物的e.e.值分别为16.2mmol/(L·h)、47.6%和92.6%。为了进一步提高反应效率,本研究尝试采用相转移的方法,以期利用第二相对底物的萃取作用,降低水相中底物浓度,从而减轻底物抑制和底物的非酶反应。本论文对比研究了6种有机溶剂(乙酸乙酯、三氯甲烷、环己烷、正己烷、正辛烷和正癸烷)对该反应的影响。其中正己烷对SO的溶解能力较强,能有效地提高反应体系中的底物浓度,并抑制底物的非酶水解,提高了产物的e.e.值。与其他有机溶剂相比,正己烷为最适有机相。在正己烷/缓冲液双相体系中,反应的最适两相体积比(正己烷/缓冲液)、反应温度、缓冲液pH值、振荡速度和底物浓度分别为1:1、35℃、6.5、220r/min和20mmol/L;在上述反应条件下,该反应的初速率、产率和产物的e.e.值分别为5.4mmol/(L·h),49.2%和94.3%。本研究尝试在正己烷/缓冲液双相反应体系中加入亲水ILs,以期提高酶的催化活性和减轻底物的非酶水解,从而进一步提高酶促反应的效率。添加不同亲水性ILs对绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响各异。当ILs的阳离子含羟基时,如C2OHMIM·BF4,ILs对酶的毒性较低,因此该反应在含C2OHMIM·BF4的正己烷/缓冲液双相反应体系中具有最高的反应初速度、产率和产物e.e.值,EHs表现出最佳的催化效果。此外,在正己烷/缓冲液双相反应体系中加入亲水离子液体C2OHMIM·BF4,能进一步抑制底物的非酶水解,并提高反应速度和底物浓度,从而提高反应效率。含C2OHMIM·BF4的正己烷/缓冲液双相反应体系中,绿豆EHs催化SO不对称水解反应的最适ILs浓度、反应温度、缓冲液pH值、振荡速度和底物浓度分别为4%(v/v)、35℃、6.5、220r/min和32mmol/L;在上述反应条件下,该反应的初速度、产率和产物e.e.值分别为9.7mmol/(L·h)、49.4%和95.3%。研究表明,含有机溶剂的反应体系对EHs的毒性较大,导致酶的催化活性大大下降。为解决上述问题,本文采用具有良好生物相容性的新型介质ILs替代有机溶剂作为第二相。在所研究的9种疏水ILs中,C4MIM·PF6具有最好的生物相容性,同时对底物SO的溶解能力较强,故能有效地提高反应体系中的底物浓度。此外,在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中底物的非酶水解受到明显抑制,从而大大提高了产物的e.e.值,因此C4MIM·PF6为最适ILs相。在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中,反应的最适两相体积比(C4MIM·PF6/缓冲液)、反应温度、缓冲液pH值、振荡速度和底物浓度分别为1:6、35℃、6.5、220r/min和100mmol/L;在上述反应条件下,该反应的初速率、产率和产物的e.e.值分别为18.4mmol/(L·h),49.4%和97.0%。本研究不仅有助于丰富对含ILs介质中酶催化特性的认识,还提供了一条制备对映体纯手性邻位二醇的行之有效的新途径。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-15
第一章 绪论  15-22
  1.1 手性环氧化物及邻位二醇  15
  1.2 环氧化物水解酶  15-19
    1.2.1 EHs的结构  16
    1.2.2 EHs的催化机制  16
    1.2.3 EHs的应用  16-18
    1.2.4 EHs在非水相体系中的应用  18-19
  1.3 离子液体  19-21
    1.3.1 离子液体的简介  19-20
    1.3.2 离子液体中的生物催化与生物转化  20-21
  1.4 本研究的主要内容和意义  21-22
第二章 水相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应  22-31
  2.1 实验材料  22
  2.2 主要仪器设备  22-23
  2.3 实验方法  23-25
    2.3.1 绿豆EHs的粗酶制备  23
    2.3.2 绿豆EHs粗酶中的蛋白质含量及酶活力的测定  23
    2.3.3 反应温度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  23
    2.3.4 缓冲液pH值对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  23-24
    2.3.5 振荡速度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  24
    2.3.6 底物浓度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  24
    2.3.7 产物浓度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  24
    2.3.8 气相色谱(GC)分析  24-25
    2.3.9 液相色谱(HPLC)  25
    2.3.10 反应初速度、产率和产物对映体纯度的确定  25
  2.4 结果与讨论  25-30
    2.4.1 反应温度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  25-26
    2.4.2 缓冲液的pH值对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  26-27
    2.4.3 振荡速度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  27-28
    2.4.4 底物浓度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  28-29
    2.4.5 产物浓度对绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  29-30
  2.5 本章小结  30-31
第三章 有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应  31-43
  3.1 实验材料  31
  3.2 主要仪器设备  31
  3.3 实验方法  31-34
    3.3.1 绿豆EHs的粗酶制备  31
    3.3.2 绿豆EHs粗酶中的蛋白质含量及酶活力的测定  31
    3.3.3 底物和产物在有机溶剂/缓冲液两相中分配系数的测定  31-32
    3.3.4 不同有机溶剂对绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  32
    3.3.5 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  32
    3.3.6 温度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的反应影响  32-33
    3.3.7 缓冲液pH值对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  33
    3.3.8 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  33
    3.3.9 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  33-34
    3.3.10 气相色谱(GC)分析  34
    3.3.11 液相色谱(HPLC)  34
    3.3.12 反应初速度、产率和产物对映体纯度的确定  34
  3.4 结果与讨论  34-41
    3.4.1 不同有机溶剂对绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  34-36
    3.4.2 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  36-37
    3.4.3 温度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  37-38
    3.4.4 缓冲液pH对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  38-39
    3.4.5 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  39-40
    3.4.6 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  40-41
  3.5 本章小结  41-43
第四章 含亲水性ILs的有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应  43-55
  4.1 实验材料  43
  4.2 主要仪器设备  43-44
  4.3 实验方法  44-47
    4.3.1 绿豆EHs的粗酶制备  44
    4.3.2 绿豆EHs粗酶中的蛋白质含量及酶活力的测定  44
    4.3.3 不同亲水性ILs对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  44
    4.3.4 ILs浓度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  44-45
    4.3.5 底物和产物在含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中分配系数的测定  45
    4.3.6 温度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  45
    4.3.7 缓冲液pH值对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  45-46
    4.3.8 振荡速度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  46
    4.3.9 底物浓度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  46
    4.3.10 气相色谱(GC)分析  46
    4.3.11 液相色谱(HPLC)  46
    4.3.12 反应初速度、产率和产物对映体纯度的确定  46-47
  4.4 结果与讨论  47-54
    4.4.1 添加不同亲水性ILs对正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  47-49
    4.4.2 ILs浓度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  49-50
    4.4.3 底物和产物在含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中的分配系数  50
    4.4.4 温度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  50-51
    4.4.5 缓冲液pH值对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  51-52
    4.4.6 振荡速度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  52-53
    4.4.7 底物浓度对含C_2OHMIM·BF_4的正己烷/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  53-54
  4.5 本章小结  54-55
第五章 疏水性ILs/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应  55-67
  5.1 实验材料  55
  5.2 主要仪器设备  55
  5.3 实验方法  55-58
    5.3.1 绿豆EHs的粗酶制备  55-56
    5.3.2 绿豆EHs粗酶中的蛋白质含量及酶活力的测定  56
    5.3.3 底物和产物在ILs/缓冲液两相体系中分配系数的测定  56
    5.3.4 不同ILs对绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  56
    5.3.5 两相体积比对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  56-57
    5.3.6 温度对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  57
    5.3.7 缓冲液pH值对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  57
    5.3.8 振荡速度对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  57-58
    5.3.9 底物浓度对C_4MIM·PFB_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  58
    5.3.10 气相色谱(GC)分析  58
    5.3.11 液相色谱(HPLC)  58
    5.3.12 反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定  58
  5.4 结果与讨论  58-66
    5.4.1 不同疏水性ILs对绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  58-60
    5.4.2 两相体积比对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的影响  60-61
    5.4.3 温度对CB4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  61-62
    5.4.4 缓冲液pH值对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  62-63
    5.4.5 振荡速度对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  63-64
    5.4.6 底物浓度对C_4MIM·PF_6/缓冲液双相体系中绿豆EHs催化SO不对称水解的影响  64-65
    5.4.7 不同介质中绿豆EHs催化SO不对称水解反应的比较  65-66
  5.5 本章小结  66-67
结论与展望  67-70
参考文献  70-77
附录  77-80
攻读硕士学位期间发表论文情况  80-82
致谢  82-83
答辩委员会对论文的评定意见  83

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 物理化学(理论化学)、化学物理学 > 化学动力学、催化作用 > 催化 > 催化反应
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